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浙江工业大学海洋学院1对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究兰德新（同组：李建鑫）浙江工业大学海洋学院食工1201摘要：目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——QSepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。为我们将来的实验奠定了技术上的基础。关键词：蔗糖酶，QSepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE文献综述:蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2],其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用2.参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用3.参与细胞对胁迫的响应4.参与植物的生长发育5.在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性浙江工业大学海洋学院2测定方法，而且也测定了该酶的部分性质及其在植物体内的时空分布。通过基因工程手段调节植物光合产物和代谢产物的分配是当今研究的热点。植物中蔗糖酶的研究正向分子水平方向发展，无论是其分子结构和作用机理，还是基因表达和调控，都为应用基因工程调节光合产物及代谢组分奠定了基础。对于蔗糖酶的研究，还有很多有待解决的问题：植物蔗糖酶同工酶的种类比较多，其在植物中的特定作用还不甚清楚；蔗糖酶与蔗糖含量有时并不相关，尽管一些转基因植株检测表明其蔗糖酶活性大大降低，但蔗糖水平却与对照差不多；应用基因工程技术抑制蔗糖酶的活力在一些转基因植株的发育过程中也不一致；是否还有其他的代谢产物或物质调控蔗糖酶的表达等。因此关于蔗糖酶的研究还有待进一步深入，需要把生理、生化以及分子生物技术有机结合在一起，对于这些问题的最终解决将有助于更好地理解蔗糖酶在植物中的生理作用。实验1.蔗糖酶的提取及初步提纯1.1材料与方法1.1.1试剂①新鲜的啤酒酵母（冰冻在冰箱内，由实验室从啤酒厂买来）；②醋酸钠（AR）；③甲苯（AR）；④4mol/L醋酸；⑤95%乙醇（-20℃）；⑥0.5mol/LTris-HClpH7.3缓冲液。称取121.1gTris溶于1500ml的蒸馏水中，用4mol/LHCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5mol/LTris-HClpH7.3缓冲液。⑦0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液：将0.5mol/LTris-HClpH7.3缓冲液稀释10倍即得。注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。1.1.2器材①锥形瓶250ml（×1），50ml（×1）；②量筒10ml（×1）25ml（×1）;③烧杯100ml（×1），1000ml（×1）；④具塞试管10ml（×3）；⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸；⑥培养箱；⑦恒温水浴箱；⑧磁力搅拌器，搅拌子；⑨高速冷冻离心机。浙江工业大学海洋学院31.1.3操作方法1．酵母的自溶在250ml锥形瓶中加入冰冻的啤酒酵母20g、醋酸钠1.6g，搅拌15~20min，使团块的鲜酵母液化，加1.5ml甲苯用大小合适的软木塞将瓶口塞住，摇动10min使甲苯和酵母液充分混匀，放入37℃培养箱中保温60h，使酵母自溶。因本实验采用的是啤酒酵母，故酵母自溶时散发着浓烈的酒香。经自溶后，酵母液得到颜色加深。2．初提取液A在培养箱中取出装有已自溶酵母的锥形瓶，加10ml蒸馏水，摇匀，倒入塑料离心管中，平衡（分给同学酵母液少许少许）后用高速冷冻离心机4℃、15000r/min离心10min。经离心一次后，离心管中的悬液分两层，上层为黄褐色浆状液体，下层为固体，呈斜面状。取上层液体后再次离心，再取上层液体记体积为VA=19.3ml。取3ml保存，用于后续实验，所提取的液体为初提液A。3．热提取液B将初提液A倒入50ml锥形瓶中，加入3.2ml4mol/L的HAc，变为悬浊液，摇匀后入50℃水浴中20min。溶液的颜色变浅，呈乳白色。迅速放入冰块中冷却，倒入离心管中，离心，取得上清液，为淡黄色澄清液体，得VB=19.5ml。取3ml保存，用于后续实验。4．乙醇沉淀提取液C将热提取液B倒入100ml小烧杯中，将烧杯放入冰浴中边搅拌边缓慢滴加（-20℃）95%的等体积冰乙醇，30min后继续搅拌5min，烧杯底部产生白色固体，取液体，离心，保留离心管中的固体，用0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液溶解烧杯中的固体，与离心管中固体一起再次离心，得Vc=5.6ml。1.2结果与讨论VA总=VA=19.3mlVB总=VB·[VA/(VA-3)]=23.1mlVC总=Vc·[VA/(VA-3)]·[VB/(VB-3)]=Vc·[VB总/(VB-3)]=7.84ml。酵母菌自溶的时间超过60h不可太多，否则可能使蛋白酶进一步自溶，酶量减少。也可以用其他酵母品种。如酵母粉（超市有售），可使采购原料、实验操作更为简便。50℃下，除了蔗糖酶，可能有其他酶未完全失活，仍留在上清液中。用乙醇沉淀蔗糖酶时，添加过程中乙醇温度会回升，达不到要求的-20℃，或者可能有其他与蔗糖酶在乙醇中行为相似的酶，造成误差。1.3结论VA总=19.3mlVB总=23.1mlVC总=7.84ml。浙江工业大学海洋学院42．实验2.蔗糖酶的纯化——QSepharose-柱层析法2.1材料与方法2.1.1试剂①0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液；②1mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液；③0.5mol/LNaOH；④QSepharose，长期保存需置于20%乙醇中，4℃保存。注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。2.1.2器材①层析柱；②梯度混合器;③磁力搅拌器，搅拌子；④紫外分光光度计；⑤点滴板；⑥尿糖试纸、擦镜纸；⑦止水夹；⑧烧杯、试管。2.1.3操作方法1．离子交换柱的填充将层析柱垂直固定，加水，排除气泡，再加少量水，装入离子交换剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不得干柱）。2．缓冲液盐度梯度发生器的安装两个杯子的左边一个杯子内加25ml含NaCl的0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液，右边25ml的Tris-HClpH7.3缓冲液（不得装反），排除气泡（为了保证连通），在低浓度一段装入搅拌子。3．柱的平衡将柱子与恒流泵连通，用25mlTris-HClpH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。4．加样将缓冲液放至刚好与交换剂相切，取0.5mlC液，加入交换柱，再放至刚好与交换剂相切，夹紧夹子，上方需加5ml左右的缓冲液。以每管3ml收集加样后液体。共收集9管液体（记为1~9号）。5．洗脱为防止液面低于交换剂表面，加入了5ml缓冲液。①0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液25ml洗穿透峰。连通梯度发生器，进行线性梯度洗脱，直到缓冲液全部用完，再用0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液配置的1mol/lNaCl溶液25ml洗脱。期间总共收集13管液体（记为10~22号）。②离子交换柱的再生。6．测OD值在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。得到各管的OD值如下：浙江工业大学海洋学院5表2-1加样流出液及洗脱液OD280测定结果表试管号OD值试管号OD值10.371120.10022.673130.11331.636140.12040.120150.40150.063160.35360.069170.22770.052180.17580.042190.09790.045200.069100.115210.054110.094220.0437.酶活力的测试用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取15，16两组。酶活力测试方法：在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。得到15管为3+，16管为2+，合并成一管，结果为VD=4.3ml注:用+-表示酶活力+多活力大。2.2结果与讨论VD总=VD·VC总/V样=4.3×7.84/0.5=67.42ml由数据得表如下：QSepharose-柱层析法提纯酶数据处理表装柱时不得干柱。此次试验中由于不慎，可能存在干柱的嫌疑。不过及时又添加了Tris-HClpH7.3缓冲液，对本次试验的结果影响减到了较小的程度。梯度发生器第一次失误的过程，结果相当于多做了洗穿透峰。在以每管3ml分装液体时，不能很好地控制流量，每管不一定均为标准3ml。2.3结论VD总=67.42ml3．实验3.蔗糖酶活力的测定3.1材料与方法3.1.1试剂①3,5-二硝基水杨酸浙江工业大学海洋学院6（1）甲液：溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。（2）乙液：称取255g酒石酸钾钠加到330ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液。将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用，在室温放置7~10天后使用。②葡萄糖标准溶液（0.2mg/ml）准确称取20mg分析纯葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量移入100ml的容量瓶中，定容。5%蔗糖、；③0.2mol/LpH4.6醋酸缓冲液溶解10.83g醋酸钠于水中，加近260ml的1mol/L醋酸调pH到4.6，稀释至2L；④5%蔗糖用0.2mol/LpH4.6醋酸缓冲液配置；⑤2mol/LNaOH溶解0.80g氢氧化钠于10ml水中。3.1.2器材①电炉；②恒温水浴;③紫外分光光度计；④试管、吸管；3.1.3操作方法1．葡萄糖标准曲线的制作取6支试管，分别按表3-1加入各种试剂。将各管内液体混合均匀，在沸水浴加热5min。取出后立即用冷水冷却到室温，于540nm波长处测OD值，以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。表3-1葡萄糖标准曲线的制作试管号012345葡萄糖00.81.01.21.41.6蒸馏水3.02.22.01.81.61.4DNS1.51.51.51.51.51.5总体积4.54.54.54.54.54.5OD0.0000.2170.3850.5540.7360.8892．酶活力测定①将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释：初提取液A（1：200）；热提取液B(1:200)；乙醇提取液C（1：200）；柱分离液D（1：20）。②取8支试管，按表3-2加入各种试剂。表3-2酶的催化反应项目A（1：200）B(1:200)C（1：200）D（1：20）加样A对A样B对B样C对C样D对D样酶液/ml222222222NNaOH0.5—0.5—0.5—0.5—35℃预热10min，同时预热5%蔗糖5%蔗糖22222222立即摇匀，准确计时，反应3min2NNaO