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ThenhowtogetsiRNA?siRNA制备方法InvitroＡ、化学合成Ｂ、体外转录Ｃ、酶切长链dsRNAInvivoＤ、载体表达siRNAＥ、PCR合成siRNA表达元件A.化学合成法方法简单、快速，需要时间短；获得的siRNA纯度高适用于短期体外实验研究，尤其适用于需要单一siRNA序列的研究siRNA可进行标记需要进行大规模的筛选来确定单一的siRNA序列不适用于长期研究不适用于siRNA序列的筛选选择以AA开头的19-21nt长的序列靶定序列从起始密码子下游75-100个nt处开始，到终止密码子上游75-100nt处结束选择2-4个靶定序列，以筛选特异性最好的进行实验选择的序列中GC含量在30-70%,最好在50%左右,在一排序列中避免出现3个以上G。若需要发卡结构，发卡部分长度一般为6-9nt，有文献报道9nt效果较好.最后,选择的DNA片段经BLAST查询,应与其它人类基因无同源性设定适当的对照siRNA序列设计注意事项设置适当的siRNA对照1)与靶定siRNA有相同的碱基组成，但排列完全不同，且不与其它基因由同源性AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGSN(G4,C5,A5,T6)ATTCGTGCTCAATGCAATCGNSN(G4,C5,A5,T6)2)1-2碱基错配的siRNA对照(1-2nt)AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGAGCCTTAGTTTAAATCCTAGT和A错配siRNA序列设计根据文献报道，使用确定的siRNA序列许多网站提供siRNA设计软件，只需输入靶定基因序列，即可提供候选siRNA序列；比如Ambion公司,武汉晶赛B、体外转录合成短的siRNAT7RNA聚和酶体外转录DNA，直接产生小片断的siRNA，快速、灵活，适用于siRNA序列的筛选以及化学合成siRNA价格昂贵时siRNA可进行标记可重复性差，不适用于长期研究和需要大量单一siRNA序列的研究C、使用Dicer酶切长片断dsRNA产生siRNA使用T7RNA聚和酶体外转录,产生长片断的dsRNA，然后使用Dicer酶消化，产生短的siRNA产生的为siRNA的混合物，因此沉默效果较好该方法方便、简单、需要时间短，容易操作适用于快速而便宜的表型功能缺失研究可对产生的siRNA进行标记不适用于长期研究和需要确定的单一siRNA的研究可能产生非特异性的基因沉默１、含有T７启动子的PCR产物的合成２、长的dsRNA的转录合成３、siRNA的消化，和纯化D1、质粒载体合成siRNA（非病毒）•首先合成具有发卡结构的DNA，构建到含有U6或者H1启动子的质粒中，质粒转入细胞，在启动子操纵下转录生成siRNA;•该方法可在胞内持续产生siRNA，适用于长期研究;•价格较贵，构建过程相对复杂，只适用于体外研究D2、病毒载体合成siRNA•siRNA在病毒骨架上进行转录，适用于原代细胞、可进行体内和体外实验；有可能进行稳定转染•使用腺病毒载体：可进行体内实验，转染效率高•使用逆转录病毒载体：可进行整合，导致稳定转染•构建过程复杂，成功率相对较低，而且具有安全隐患E、PCR方法构建siRNA表达元件（SEC)•PCR方法构建含有特定启动子和终止子以及靶定DNA序列的表达元件•转染到胞内后，在启动子操纵下，siRNA表达•方法简单，无需构建载体；•适用于siRNA序列筛选，及载体克隆前启动子的筛选•不适用于长期研究常用的发卡结构中Loop环的长度和序列化学合成体外转录核糖核酸酶消化dsRNASiRNA表达载体PCR表达元件需要条件21-merRNA片断29-merDNA片断转录模板(200-800bp侧翼含有T7启动子)55-60-merDNA片断~50-merDNA片断需要的时间4天-2周24小时加上DNA准备时间1天加上转录模板准备时间5天加上DNA准备时间~6小时加上DNA准备时间工作量少或无中等中等高中等是否需要检测优化siRNA序列需要需要需要不需要需要可否进行标记（以分析转染效率和显微镜定位可以可以可以不可以不可以转染的容易程度好好好很容易很容易可否筛选（即抗生素筛选）不可以不可以不可以可以不可以可否用于长期研究不不不带有选择性标志则可以不能否大规模合成可以受限受限可以受限能否检测群体的转染效率不不不可以不每个基因需要的费用（不包括劳力）高中等抵中等中等ＲＮＡ干扰的应用（Application）•基因功能的研究（Genefunction）•基因治疗（Genetherapy）---遗传性疾病（Hereditarydisease）---病毒感染引起的疾病（Diseasesbyvirus）：如艾滋病，肝炎等---肿瘤（Tumor）•新药开发（Developmentofnewdrugs）RNAi技术的应用:基因治疗疾病/病毒靶基因细胞细胞来源效果HIV-1CCR5CD4+TT细胞阻止病毒侵入HIV-1Tsg101293T肾脏阻止病毒出芽HIV-1Tat，RTJurkat白血病抵制病毒繁殖C型肝炎病毒NS3,NS5BHuh7肝癌抵制病毒繁殖脊髓灰质炎病毒polHeLaS3子宫癌抵制病毒繁殖劳氏肉瘤病毒FusionproteinA549肺癌抵制病毒繁殖乳头状瘤病毒E6，E7CasKi子宫颈癌细胞凋亡流感病毒CapsidMDCK上皮细胞抵制病毒繁殖乳腺癌P53MCF-1乳癌阻止细胞停在期胰腺癌K-RASV-12CAPAN-1胰腺癌抑制肿瘤形成大肠癌K-rasSW480大肠癌抑制细胞增殖白血病Bcr/ablK562白血病抑制bcr/abr细胞RNA干扰最初的研究多局限于植物、线虫和果蝇等的研究.对哺乳动物的研究则是在最近几年,对其发生机制有了初步了解后才开始的.RNA干扰技术在实验动物体内的研究目前在国内还鲜有报道,在国外也不多见.目前的研究多局限于细胞水平.如何将siRNA安全有效地导入动物体内,即载体的选择,是制约RNA干扰技术在实验动物体内应用的瓶颈之一.但RNAi诱人的应用前景仍吸引着许多科学家,研究小组,实验室以及国际知名的生物公司投入到这放方面的研究.国内外研究现状和发展趋势如Brummelkamp等建立了突变体K-rasV12的siRNA表达系统pSUPER-K-rasV12,通过转染人胰腺癌CAPAN-1细胞系,观察其抑制内源K-rasV12的表达,结果显示pSUPER-K-rasV12能显著降低K-rasV12的mRNA表达水平,而对照组cyclinD1的表达水平没有影响;构建突变体K-rasV12的siRNA病毒载体转染CAPAN-1细胞能明显抑制细胞克隆的生长,以及阻止裸鼠肿瘤的形成,而对照组细胞生长良好并产生克隆,体内裸鼠实验5周内均长出肿瘤,因此证明了siRNA具有明显的特异性和抑制肿瘤生长作用,为肿瘤研究提供了新的技术方案[21]。Wilda等[22]设计了M-BCR-ABL融合蛋白的dsRNA,通过转染白血病细胞株K562细胞,研究对白血病细胞的杀灭作用。结果表明siRNA能明显降低bcr-abl的mRNA表达水平,减少bcr-abl癌基因的表达,导致白血病细胞的凋亡.Cioca等[23]报道采用siRNA转染人髓白血病细胞系HL-60,U937,THP21,K562,观察其对内源性c-raf和bcl-2基因的抑制作用以及对肿瘤细胞分化、凋亡和对药物足叶乙甙(etoposide)和柔红霉素(daunorubicin)敏感性的影响。结果表明,siRNA能减少raf-1和bcl-2蛋白的表达;c-raf的siRNA能阻止佛波醇酯(TPA)诱导的单核细胞分化;c-raf和bcl-2的siRNA能诱导人髓细胞性白血病细胞HL-60,U937,THP-1凋亡;siRNA联合抗癌药物足叶乙甙和柔红霉素能明显提高药物的作用效果。因此作者认为RNAi可用于人髓细胞性白血病的研究和治疗,并克服癌细胞对抗癌药物产生的抗性,最终提高人髓性白血病的化疗效果。尽管RNAi应用于肿瘤的研究才刚刚起步,但科学家已经认识到其在肿瘤研究中的巨大潜力。应用RNAi技术抑制肿瘤细胞中过量表达的一些凋亡抑制剂如bcl-2、c-myc等,将有利于癌症的治疗。因此可以认为RNAi是继PCR后又一划时代的基因工程方法,是肿瘤治疗的新希望。它的发现为后基因组时代系统的研究基因的功能提供了一个高效的研究方法,同时为我们在治疗某些难治性疾病如肿瘤、病毒性疾病等方面提供了丰富的想象空间一点声明本ppt是我在准备课题时,在查阅资料.浏览他人文献上基础上根据自己的认识撰写而成.文中自然引用了前辈们的某些精华.其中就有丁香园里的帖子.这里就不一一列出.在此一并致谢.