搜索
课题二、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定(一)、目的基因的获取获取目的基因是实施基因工程的第一步。可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。目的基因：主要是指编码蛋白质的结构基因获取目的基因的方法：①从基因文库中获取（基因组文库，部分基因文库）②利用PCR技术扩增目的基因（变性，复性，延伸）③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成目的基因来源（三）基因操作的基本步骤•步骤一：目的基因的提取2）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA(cDNA)双链DNA(即目的基因)反转录合成3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成人工合成基因合成蛋白质的氨基酸序列推测mRNA推测目的基因结构基因的核苷酸序列目的基因的mRNA反转录单链DNA双链DNA合成反转录法人工合成基因编码区非编码区非编码区原核生物的基因结构与RNA聚合酶结合位点启动子与起始密码终止子与终止密码起始密码终止密码启动子终止子真核生物的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点信使RNA成熟的信使RNA(二)、基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。目的：使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停止下来。标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。(三)、将目的基因导入受体细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（1）目的基因导入植物细胞常用：---农杆菌转化法(感染双子叶植物和裸子植物)基因枪法花粉管通道法（2）将目的基因导入动物细胞显微注射技术（3）将目的基因导入微生物细胞常用大肠杆菌：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少大肠杆菌的转化方法：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。四、目的基因的检测和表达目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传性状，只有通过检测与鉴定才能知道。这是检查基因工程是否成功的一步。首先，要检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。检测方法是采用DNA分子杂交技术其次，还需要检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。检测方法是采用DNA分子杂交技术最后，检测目的基因是否翻译成蛋白质。检测方法是进行抗原---抗体杂交Sourthern杂交-----DNA与DNA分子间的杂交(见同步导学12页)将受体生物的DNA提取出来，经过适当的酶切后，走电泳，将大小不同的DNA片段分开，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上，用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明受体生物染色体DNA上有目的基因。Northern杂交----DNA与RNA分子间的杂交Western杂交-----蛋白质分子间的杂交（抗原---抗体）个体生物学水平的鉴定：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。1）以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A练习4）有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D练习5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达C练习生长快、肉质好的转基因鱼(中国)乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄提取目的基因基因表达载体的构建目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定