微生物农药研发与应用

微生物农药研发与应用1-第一章总论也许你们不禁要问，什么是生物农药？生物农药是指含非人工合成、具有杀虫杀菌或抗病能力的生物活性物质或生物制剂，包括生物杀虫剂，杀菌剂，农用抗生素，生态农药等。现在也包含这些天然产物的一些简单衍生物，即化学修饰产物，如甲氨基阿维菌素、乙烯利等。生物农药的准确提法应该是生物源农药，早期的天然农药、植物农药、微生物农药等都归在其中。生物源农药包括植物源、动物源农药和微生物源。微生物农药是指应用生物活体及其代谢产物制成的防治作物病害、虫害、杂草的制剂。也包括生物活体的保护剂、辅助剂和增效剂以及模拟某些杀虫毒素和抗生素的工合成的制剂。利用微生物防治害虫最早可追溯到100年前．俄国人梅契尼可夫利用绿僵菌防治金龟子幼虫，但直到本世纪50年代“以菌治虫”的研究和生产才得到迅速发展。近30年，微生物农药在农药生产上已广泛应用，特别是在化学农药污染环境的问题日益突出的今天，微生物农药的研究和生产更加受到重视。目前，微生物农药主要包括微生物杀虫剂、农用抗生素和微生物除草剂等。微生物杀虫剂的种类很多，已发现的有2000多种，主要包括细菌、放线菌、真菌、病毒、立克攻氏体、线虫和原生动物等。目前，国内外研究、利用的主要是细菌、真菌和病毒。第二章病毒杀虫剂第一节病毒杀虫剂研究与开发的现状及前景病毒杀虫剂是利用昆虫病毒的生命活动来控制那些直接和间接对人类和环境造成危害的昆虫。一、昆虫病毒的基本特性一个病毒粒子的基本结构（核酸、衣壳蛋白、有的有囊膜），有些病毒粒子被包埋在由蛋白质晶体构成的包涵体内，称为包涵体病毒，包涵体病毒的形态多样，有呈多角形，称为多角体（所含病毒粒子从1-1000）大小约为1—1.5um；有呈椭圆形或圆形的，称为颗粒体（1或2个病毒粒子）大小约为0.1-0.5um。有包涵体的病毒，由于其外层的结晶排列的蛋白质对外界不良环境的抵抗力强。二、昆虫病毒的分类早期昆虫病毒的分类主要是依据病毒有无包涵体、包涵体的形态、病毒粒子的形态和结构，在寄主的何种组织内发育等。依据这些特点，将昆虫病毒分为5类：①核型多角体病毒，多角体于细胞核内形成②质型多角体病毒，多角体于细胞质内形成③颗粒体病毒，包涵体存在于细胞核或细胞质内④昆虫痘病毒⑤非包涵体病毒（P4）三、感染途径1、取食感染；2、经皮肤感染四、病毒杀虫剂的生产工艺（以棉铃虫核型多角体病毒制剂为例）1、棉铃虫幼虫的饲养繁殖；2、以人工方法使棉铃虫幼虫感染病毒；3、收集多角体；4、加工配制一定剂型的制剂。五、病毒杀虫剂的优点1、宿主特异性高，能杀灭害虫而不影响害虫的天敌；2、不会污染环境；3、后效作用明显；4、昆虫病毒制剂生产容易、使用方便、成本低廉、适于推广。六、病毒杀虫剂的缺点1.杀虫范围太窄2.生产困难3.作用速度较慢七、病毒杀虫剂在害虫防治上的应用微生物农药研发与应用2-我国至1990年已从188种昆虫中分离到220多株病毒，其中110株为我国首次分离获得．迄今，在世界各国至步有6O多种病毒进人大田进行防治农林害虫的试验，3O多种病毒杀虫剂进行了登记、注册和生产应用．目前研究较多、应用较广的是核型多角体病毒(NPV)、颗粒体病毒(GV)和质型多角体病毒(CPV)．我国迄今已有20种病毒进人大田试验。如斜纹夜蛾NPV、油桐尺蠖NPV（又名大尺蠖，茶树的一种致病昆虫）、松毛虫CPV均属“七五中试生产研究内容，棉铃虫NPV杀虫剂已进人批量生产，其他的如茶毛虫NPV、茶小卷叶蛾GV、草原毛虫NPV、茶蚕GV等相继进人大田试验．由于病毒杀虫剂具有致病力强、专一性强、抗逆性强和生产简便等优点，发展前景十分广阔，但也还存在着许多问题，如病毒的工业化生产还有困难，病毒多角体在紫外光及日光下易失活等，这都需要进一步的研究并加以解决。注：松毛虫培养在采用林间围栏的方式进行培养时，受地域、温度、季节等的因素而影响产量。八、现阶段，病毒杀虫剂的研究方向1、昆虫病毒蛋白质祖学和功能基因组学。2、昆虫病毒的进化生物学研究。3、昆虫杆状病毒表达载体系统研究。4、基因工程病毒杀虫剂的构建。通过从基因方面入手，实现病毒杀虫剂的工业化生产，提高病毒杀虫剂的产量和作用效果。第二节核型多角体病毒(NPV)核型多角体病毒是昆虫病毒中最常见的一种。已知可感染7个目中284种昆虫。（一）核型多角体病毒的概述一、核型多角体病毒的一般形态具有较大的包涵体，称为多角体，外观呈四、五、六角型、不规则型等。如粘虫病毒为六角型，家蚕病毒为十二面体。依据所包埋的病毒粒子的多少，可将核型多角体病毒分为多核衣壳核型多角体病毒（MNPV）和单核衣壳核型多角体病毒（AcMNPV）。核型多角体的直径为0.5—15um，病毒粒子的直径为20—70nm，长约200—400nm。粒子呈杆状，核心为双股DNA。二、核型多角体病毒的理化性质核型多角体病毒的主要成分是蛋白质，不同种的多角体所含氨基酸组分基本一致，核型多角体对于不同的化学药剂具有相当高的抵抗力，不溶于水及多种有机溶剂（如乙醇、丙酮、乙醚等），不为细菌或细胞蛋白酶所分解，但若以强酸或强碱溶液处理则会溶。多角体若被食入易感虫体内，能在中肠内碱性肠液中溶解并释放出粒子。三、昆虫感染核型多角体病毒后的表型昆虫感染核型多角体病毒后，食欲减退、行动迟缓、躯体变软、组织液化，有些昆虫会爬往枝头，所以又称为“梢头病”、“树顶病”。死后虫体腹足紧握枝头或枝叶，虫体下垂，倒挂枝条上，死虫皮肤脆弱，极易破裂，流出白色或褐色稀糊状液体。（二）杀虫机理（自学或同学讲解）病毒杀虫剂的机理在于利用其天然存在的致病性。（三）核型多角体病毒的改造由于野生型病毒普遍存在杀虫速度慢、效力不高等缺陷，很难进行工业化生产。随着基因工程技术的发展，人们开始尝试对野生型病毒进行各种改造，以构建性能优良的重组病毒杀虫剂。1、缺失核型多角体病毒非必需基因以增加杀虫效果2、插入昆虫自身存在和产生的激素和酶的基因以提高杀虫速度3、插入昆虫毒素基因和细菌毒素基因以提高杀虫速度微生物农药研发与应用3-4、插入植物来源基因以提高杀虫速度5、修饰病毒本身基因以扩大杀虫谱第三节质型多角体病毒（CPV）质型多角体病毒也是包涵体病毒，这和核型多角体病毒一样，但它所含的核酸为RNA。质型多角体病毒可感染的昆虫种类仅次于NPV，我国已发现的有家蚕和赤松毛虫，马尾松毛虫质型多角体病毒。（一）质型多角体病毒的概述一、质型多角体病毒的一般形态质型多角体外观呈四、五、六角型、不规则型等。质型多角体的直径约为0.5—25um，因病毒种类、感染时间长短、在细胞中形成的数量等而有很大的差异。一个多角体可包埋1—1000个病毒粒子。病毒粒子为正二十面体，表面有由四节管组成的突起。病毒粒子的大小在60—70nm之间。二、质型多角体病毒的理化性质质型多角体病毒不像核型多角体那样稳定，质型多角体虽不溶于水，但在水中经较长时间可被溶解。在碱液中的溶解度比核型多角体病毒的溶解度小，如以稀碳酸钠也处理能失去病毒粒子，留下不溶解的多角体呈多孔状。如溶解后，不像NPV那样留下膜。质型多角体也由蛋白质构成，除此之外还含有3%左右的硅。三、昆虫感染质型多角体病毒后的表型昆虫感染核型多角体病毒后，表现活跃，急躁，肠道硬化、肿大并呈乳白色，大便石灰色。死后不倒挂，体型缩小，头、胸、腹不呈正常比例，皮肤完好，不液化。四、质型多角体病毒的潜育期核型多角体病毒的潜育期一般在5-7天，而质型多角体病毒的潜育期一般是7-20天，比NPV长得多。但对两种病毒来说，潜育期长短的影响因素却是相同的，一般都与昆虫的种类、昆虫的发育阶段、病毒毒力、病毒数量、和环境温度等条件有很大的关系。五、（二）质型多角体病毒的研发与应用对质型多角体病毒的最初研究，我国是从家蚕的病害研究开始，现以从30种昆虫中发现了质型多角体病毒，如马尾松CPV、棉铃虫CPV等。我国利用质型多角体病毒防治害虫取得了较好的效果，如山东利用赤松毛虫CPV大面积防治赤松毛虫，广东和云南等地分别利用马尾松CPV和文山松毛虫CPV来防治松毛虫都取得了满意的效果。在生产上采用直接感染宿主昆虫增殖病毒，最简便的方法是在病虫害大面积发生时将病毒喷洒在植物上，然后收集病死虫。中科院武汉病毒所彭辉银等人成功研究“生物导弹”新技术，防治松毛虫获得可喜的成绩。第四节颗粒体病毒(GV）自从1926年法国的Paillot发现昆虫颗粒体病毒以来，至今至少有684种昆虫被描述患有颗粒体病毒病，我国已发现有颗粒体病毒的昆虫寄主有黄地老虎、小菜蛾、菜粉蝶等。GV的感染途径和传播方式是昆虫病毒学研究的主要内容之一，经卵传递、感病成虫的飞迁移，寄生蜂和捕食昆虫，以及食虫鸟类的传播；GV的离体传代一直是一件困难的工作。起初，人们试图从颗粒体病毒复制的组织器官中去筛选具有感染性的细胞系，未成功。经过长期探索较多成功的体外复制离体系统大多是在胚胎来源的细胞中建立的。（一）颗粒体病毒的概述一、颗粒体病毒的一般形态颗粒体呈椭圆形，表面和边沿不甚整齐，中部稍凹陷，略弯曲，其大小为330～500×200－290nm。颗粒体包含着一个杆状病毒粒子,大小为200－290×45－55nm。微生物农药研发与应用4-二、颗粒体病毒的理化性质不溶于水及多种有机溶剂（如乙醇、丙酮、乙醚等），遇强酸或强碱，包涵体会迅速溶解，并可使病毒粒子变性而失去侵染力。完整的颗粒体病毒在70-75℃间能存活10min，高温条件、紫外或其他辐射线的照射也能使完整的病毒失活。低温、干燥状态下对未提纯的颗粒体病毒保存4年以上仍有感染力。（二）颗粒体病毒的侵染后的表型感染病虫的鳞翅目幼虫食欲不振、行动迟缓、体节肿胀，虫体腹面逐渐变色呈苍白色或乳黄色，这是由于在脂肪体中产生了大量的病毒颗粒所致；皮肤上常见斑点，体色变为黄绿色，体壁常常变软或内含物液化，死虫表皮脆软易破，流出乳黄色乳状液；死虫死时倒挂树枝，呈“八字”型，后期体色变黑。（三）颗粒体病毒的增效蛋白（En）1、颗粒体病毒增效蛋白的发现1959年，Tanada实验美洲黏虫颗粒体病毒活体失活致死率提高美洲黏虫核型多角体病毒活体失活对毒性无影响致死率提高人们将在美洲黏虫颗粒体病毒中鉴定并纯化出一种蛋白质，并将这种蛋白质命名为增效蛋白。2、颗粒体病毒增效蛋白的相关性质到目前为止，已通过活性生物测定发现了11种病毒中存在增效蛋白成分，这些蛋白均为糖蛋白，大小范围在38-126ku，它们均为酸性氨基酸，并且均含有金属蛋白酶-锌结合域。所有的增效蛋白之间的空间结构比较相似。3、颗粒体病毒增效蛋白的作用机理关于颗粒体病毒增效蛋白的增效机理，学术界有几种观点，现在比较认同的观点是认为颗粒体病毒增效蛋白是破坏围食膜的一种蛋白水解酶。围食膜是无脊椎动物所特有的一种半透性膜状结构，昆虫的围食膜是由中肠细胞分泌形成的，根据分泌细胞在中肠所处的位置,可将围食膜分为Ⅰ型和Ⅱ型.由于围食膜紧贴中肠内壁,包裹着食物,因此具有保护中肠上皮细胞和有助于食物消化吸收的功能。围食膜主要是由几丁质和蛋白组装而成，其中的黏蛋白IIM（通过二S键与围食膜几丁质网状基质紧密相连）是颗粒体病毒增效蛋白的作用底物。由于增效蛋白能够降解黏蛋白IIM，增加了围食膜的通透性，使病毒粒子更容易通过围食膜，从而提高了病毒的治病率。4、增效蛋白基因工程研究今年来，人们致力于构建含有增效蛋白的重组型颗粒体病毒，可以有效提高杀虫效率。在构建工程菌的过程中，出现多种问题：如，加入增效蛋白基因后，重组病毒的形成数目大为减少，且形态也减小。经过工作者的努力，得到了既加入了增效蛋白基因又能形成正常病毒的重组体。除此之外，人们还将增效蛋白基因加入到一些工程菌中，得到产增效蛋白的工程菌，或将增效蛋白的基因片段插入到植物基因中，得到转基因植物。（四）颗粒体病毒的应用颗粒体病毒的应用不及NPV广泛，主要用于防治菜青虫、小菜蛾、及黄地老虎等。近年来，运用颗粒体病毒来防治虫害的效果显著。如北京林业科学院生物防治研究所经过多年研究，批量生产了杨扇舟蛾颗粒体病毒，该病毒对3龄以上的杨扇舟蛾幼虫治病力很高，从而控制了杨扇舟蛾害虫大面积发生；另外，中国新