微生物发酵制药

L/O/G/O微生物发酵制药L/O/G/O第一节概述利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。微生物发酵制药的定义发酵工程的4个阶段第一阶段•1676年制成第一台显微镜——微生物的存在•1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的•1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精——酶第二阶段•对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。第三阶段•20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素迅速工业大规摸生产。•深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功。第四阶段•20世纪50年代，利用代谢调控发酵氨基酸、核酸。•20世纪70年代，利用固定化酶或细胞连续发酵。•20世纪80年代，基因工程、蛋白质工程、细胞融合技术等高新技术应用阶段。1、微生物菌体的发酵SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）生物防治制剂（如苏云金杆菌）活性乳制剂细胞的生长与产物的积累成平行关系，生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段微生物发酵类型2、微生物酶发酵各种酶制剂糖化酶、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等天冬酰胺酶：抗癌纳豆激酶、链激酶：治疗血栓青霉素酰化酶：青霉素生产需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。3、微生物代谢产物发酵初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累次级代谢产物：与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等结构常较复杂对环境条件敏感4、微生物转化发酵利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链等。反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性。如：甾体转化：环戊烷多氢菲核的化合物可的松（Cortisone）药用发酵产品分类生物来源作用对象作用机制化学结构细菌真菌放线菌抗菌药抗肿瘤药抗病毒药除草剂酶抑制剂免疫调节剂抑制细胞壁合成药影响细胞膜功能药干扰蛋白质合成药抑制核酸合成药抑制生物能量反应药抗生素维生素氨基酸核苷酸甾体激素酶及酶抑制剂发酵工程制药的特点•微生物菌种选育获得高产•发酵的理论产量存在约10%的变量•发酵过程常温常压，操作条件温和•纯种培养、无菌条件•生产过程是以生物体的自动调节方式进行的•分子水平生产，定向发酵、突变、杂交等手段•投资少、见效快发展趋势•利用DNA重组技术和细胞工程技术的发展、新的工程菌和新型微生物的开发•新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、白介素促红细胞生成素等；•新型菌体制剂和疫苗。红细胞生成素(治疗贫血)生长激素(促进生长)胰岛素(治疗糖尿病)干扰素(抗病毒、抗肿瘤)L/O/G/O第二节发酵制药中的微生物常见的制药用微生物•细菌•放线菌•真菌细菌之大肠杆菌属(Escherichiacoli)•生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物•基因工程的载体细菌之短杆菌属(Brevibacterium)•维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium)•生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化•是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，•如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)•生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用于甾体转化等。细菌之假单胞菌属(Pseudomonas)•生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类；•进行类固醇（甾体）转化；•有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。细菌之乳酸杆菌属(Lactobacillus)•生产抗癌类药物放线菌•抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。放线菌之链霉菌属(Streptomyces)灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)产链霉素金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaciens)产金霉素红霉素链霉菌(Streptomyceserythreus)产红霉素龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)产土霉素放线菌之诺卡氏菌属(Norcadia)•生产利福霉素、蚊霉素等放线菌之小单胞菌属(Micromonospora)•多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M.echinospora)产庆大霉素。放线菌之游动放线菌属（Actinoplanes）•典型代表：济南游动放线菌(Actinoplanestsinanesisn)产创新霉素(creatmycin；1964)真菌之根霉属(Rhizopus)•生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。真菌之曲霉属(Aspergillus)•生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。真菌之青霉属(Penicillum)•产黄青霉(Penicillumchrysogenum)生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium)•产黄头孢霉(Cephalosporiumchrysogen)、•顶孢头孢霉菌(Cephalosporiumacremonium)都生产头孢菌素C真菌之酵母菌属(Saccharomyces)啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：生产啤酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等。红酵母(Rhodotorula)：β-胡萝卜素棉病针孢酵母(Nematsporagossypii)：核黄素真菌之其它牛肝菌属：含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺膘呤、胆碱和腐胺等生物碱。灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。发酵菌种的选育要求生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素发酵菌种的选育方法从自然界中获得新菌种诱变育种杂交育种原生质体融合基因工程从自然界中获得新菌种土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端环境等基本程序：•采样预处理富集培养筛选鉴定野生型菌株诱变育种物理或化学方法诱发突变物理诱变剂：紫外线、X-射线、γ-射线等化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质的交换基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，技术含量高，应用面广菌种保藏(Cultureconservation)目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。菌种保藏三要素典型菌种的优良纯种的休眠体；创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）；尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。菌种保藏的常用方法斜面低温保藏法石蜡油封存法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法方法名称主要特点适用范围保藏期斜面低温保藏法传代培养，4℃保藏各种微生物的短期保藏。1-6个月石蜡油封存法石蜡油隔绝空气，室温或4℃保藏各种微生物的中短期保藏，不适用某些能分解烃类的菌种。1-2年砂土管保藏法沙土管作载体，干燥器中抽真空，室温或4℃保藏产孢子微生物和芽孢细菌的长期保藏，不适用对干燥敏感的微生物1-10年麸皮保藏法麸皮作载体，干燥，4℃保藏产孢子霉菌和某些放线菌，工厂多采用此法1年甘油悬液保藏法悬浮于10-15%甘油中，需低温冰箱基因工程菌1年/10年冷冻真空干燥保藏法用保护剂制备悬液，快速冻结，减压抽真空，需冻干机各类微生物5-15年液氮超低温保藏法保护剂，超低温（-196℃），需超低温液氮设备各类微生物15年以上宿主保藏法与培养基混合直接低温保存专性活细胞寄生微生物（如病毒）菌种保藏机构•ＡＴＣＣ•ＣＣＣＣＭ•ＮＣＴＣL/O/G/O第三节发酵设备及消毒灭菌发酵的一般流程种子扩大培养培养基配制空气除菌培养基灭菌发酵生产下游处理发酵设备发酵设备——发酵罐发酵罐的特点轴封严密，泄漏少能承受一定压力、温度搅拌通风装置保证气液充分混合具有足够的冷却面积死角少，灭菌彻底适宜的径高比（高与直径的比值为2.5—4）发酵罐的类型•搅拌釜反应器•鼓泡式反应器•气升式反应器发酵辅助设备无菌空气系统•无菌空气的要求灭菌系统、管道、阀门培养基及其灭菌培养基（medium）培养基的成分•碳源、氮源、无机盐、前体物、促进剂、抑制剂培养基的类型•按组成•按状态•按用途培养基灭菌•空罐灭菌•实罐灭菌•连续灭菌L/O/G/O第四节发酵工程制药的过程与控制种子的扩大培养微生物发酵方式•分批发酵•补料分批发酵•半连续发酵•连续发酵发酵过程中的中间分析项目产物产量pH糖氨基氮菌丝形态发酵过程的影响因素及控制菌体浓度营养物质温度pH溶氧泡沫染菌发酵终点的判断菌体浓度•在适合的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系。特别是初级代谢产物。•菌体浓度过低，产物产率下降。•菌体浓度过高，产生其他影响。•措施：调节培养基中的营养物质的浓度。营养物质•碳源•氮源•磷酸盐：生长亚适量浓度•补料：半饥饿状态温度•考虑菌种及生长阶段•综合考虑其他培养条件•考虑菌种生长情况•发酵热pH•补加酸或碱和补料的方式溶氧和CO2•溶氧异常下降•溶氧异常上升措施泡沫•负面影响•措施染菌•发酵前期染菌•发酵后期染菌发酵终点的判断•提高产物的产量和经济效益•降低生产成本主要指标与中间分析项目雷同