原核表达与常用蛋白质纯化技术探讨

原核表达与常用蛋白质纯化技术探讨北京全式金生物技术有限公司比较pET、pMAL、pGEX表达系统表达和纯化的优缺点。介绍pET表达系统表达条件的优化，纯化技巧。离子交换纯化技巧未知蛋白如何选择纯化方法，纯化方法如何组合？三大表达系统比较pET系列(T7promoter,Novagen公司)T7/lac启动子，IPTG诱导表达，6XHis,标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pMAL系列(周质表达,BioLabs公司)Tac强启动子，MBP融合，可溶性表达，纯化难以控制，Maltose一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,需要去掉MBP。pGEX系列(GST融合表达,Pharmacia公司)Tac强启动子，GST融合，可溶性表达，纯化难以控制，GST一步洗脱，得到的蛋白纯度较低。需要去掉GST.三大系统纯化蛋白比较GST和MBP一个浓度一步洗脱，蛋白纯度低。MBP纯化MBP融合蛋白MBPGST纯化GSTGST融合蛋白His咪唑浓度梯度洗脱，纯化效果理想。杂蛋白咪唑梯度/mM204080120160目的蛋白His纯化pET载体诱导表达——经典的表达系统表达条件的优化：蛋白不表达，或表达量低，如何解决？温度对表达的影响培养基对表达的影响（e.g.Glucose对表达的影响）菌株的选择不同克隆表达水平的差异溶氧量与培养体积1243不同培养基表达比较pET28aBL21(DE3)pLysSLane1：表达LBLane2：LBLane3：SOBLane4：TB表达LB：LBadd0.2%glucose目的蛋白不同菌株对表达量的影响不同菌株对蛋白表达的影响1243pET28aLane1：BL21(DE3)Lane2：BL21(DE3)pLysSLane3：Rosetta(DE3)Lane4：BR21CodonPlusRIL目的蛋白1：BL21(DE3)；2：BL21(DE3)pLysS；3：Rosetta(DE3)目的蛋白M1C1I2C2I3C3I不同菌株对蛋白表达的影响pET28a载体表达真核基因菌株的优化AnotherGene含有稀有密码子：Rossetta(DE3)蛋白表达的菌株选择菌株启动子特性BL21tac(pGEX、pMal)适用于非T7启动子的表达系统，适用于毒性蛋白的表达BL21(DE3)T7(pET)适用于T7、T7/lac的表达系统，适用于非毒性蛋白的表达BL21(DE3)pLysST7(pET)含有质粒pLysS，具氯霉素抗性，该质粒含有表达T7溶菌酶的基因，可降低目的基因的背景表达水平。适用于毒性和非毒性蛋白的表达Rosetta(DE3)T7(pET)补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平BL21CodonPlusRILT7(pET)适用于富含AT的真核生物基因的表达BL21CodonPlusRPT7(pET)适用于富含GC的真核生物基因的表达OrigamiT7(pET)具有thioredoxinreductase/glutathionereductase双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高主要是溶氧量的问题,可以通过在摇瓶中加入不同量的培养基的方式来确定最佳体积一般不要超过容器容积的1/10，最多不超过1/5包涵体成因：蛋白合成速度过快，无法正确折叠解决办法选择不同的菌株与载体的组合降低蛋白表达的速度影响蛋白积累的速率：温度，转速，IPTG浓度，诱导OD值……Origami宿主菌thioredoxinreductase/glutathionereductase双突变，帮助形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。12312312337℃25℃18℃不同温度下的表达对包涵体蛋白形成的比较Lane1:全菌蛋白Lane2:沉淀蛋白（包涵体）Lane3:上清蛋白（可溶）His蛋白纯化基本原理影响纯化的因素咪唑浓度与pH值——咪唑对蛋白纯化的影响离子强度去垢剂、还原剂与螯合剂常见问题带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上Ni-chelating分离纯化的效果不好;目的蛋白目的蛋白咪唑梯度/mM10204080120咪唑梯度/mM10204080120Buffer中咪唑初始浓度0Buffer中咪唑初始浓度10mMBuffer中咪唑初始浓度对His纯化的影响蛋白不结合His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加0.5mMEDTA来去除重金属离子的干扰His-tag被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较罕见）纯化效果不好样品没有很好细心去除不溶性物质——可以离心或过滤重复使用前树脂没有洗干净——充分洗净树脂并再生较多杂蛋白——提前终止表达引入的杂蛋白，可采用C端融合——链间二硫键的存在导致杂蛋白出现，可加入还原剂（β-ME）——去垢剂（Triton、Tween、NP40）——甘油与NaCl离子交换选择离子交换剂根据序列计算等电点分离纯化的Buffer应使蛋白稳定。根据BufferpH与等电点的大小选择纯化填料洗脱方式：改变pH值或增加盐浓度——阴离子交换剂：降低pH值，洗脱增加——阳离子交换剂：升高pH值，洗脱增加——增加盐浓度，洗脱增加（常用）等电点吸附于阳离子交换剂吸附于阴离子交换剂BufferpH值蛋白质净电荷+-蛋白净电荷与pH关系及交换剂选择选择起始Buffer的pH一般选择接近中性的pH值，通常情况下，蛋白在中性pH值的缓冲体系中稳定过酸或过碱的溶液不利于蛋白的稳定，特别对于需要活性的蛋白，pH值的选择更重要缓冲体系的pH与待纯化蛋白的等电点之间，一般相差0.5~1个pH——相差过大，蛋白结合牢固，难于洗脱——相差过小，蛋白不容易与交换剂结合——经验性数据，因蛋白与填料而异，有时需要尝试、优化选择起始Buffer中的离子强度离子强度越低，蛋白与离子交换剂结合越紧密但是，也会增强其它蛋白的非特异性结合离子强度越高，蛋白与离子交换剂结合越困难但是，也会抑制其它蛋白与离子交换剂结合，增进特异性结合，有助于纯化。需要通过实验摸索合适的条件，优化纯化工艺NaCl浓度NaCl浓度初始NaCl浓度20mM初始NaCl浓度50mM初始NaCl浓度100mM初始NaCl浓度对离子交换纯化(DEAE)的影响目的蛋白常用离子交换剂举例——DEAEFastFlow、P11DEAESepharoseFastFlow:弱碱型阴离子交换剂，流速快，使用及再生方便，易于操作。P11：属于离子交换纤维素，强酸型阳离子交换剂交换容量大，回收率高。成本相对低廉。填料需经过酸洗、减洗等处理步骤，使用前需要充分平衡，操作较复杂未知蛋白纯化方法的选择根据载体选择纯化方法根据蛋白质性质热稳定蛋白---热变性初分离抗体-抗原，底物-抑制剂，例如RNaseInhibitor纯化----CNBr-activatedSepharose硫酸铵沉淀与透析蛋白的稳定与活性——Glycerol不同纯化方法的组合纯化方法的组合需要结合待纯化蛋白的特性，综合考虑各种纯化方法的适用条件，选择合适的纯化方法与不同纯化步骤的次序。例如：His蛋白纯化时，要小心Buffer中螯合剂（EDTA）与还原剂（DTT）的影响而进行离子交换纯化时，则必须考虑Buffer与样品的pH值和离子强度，尤其是细菌裂解后，细胞内物质的释放对pH值与离子强度的影响硫酸铵沉淀与透析的搭配使用包涵体蛋白的变、复性与纯化以CarbonicAnhydrase为例，组合不同的纯化方法方法1：确认表达→裂解菌体、离心保留上清→His纯化，确认纯化效果→合并目的蛋白，透析→离子交换纯化，确认目的蛋白→合并目的蛋白方法2：确认表达→裂解菌体、离心保留上清→硫酸铵沉淀、溶解、透析→离子交换纯化，确认目的蛋白His纯化，确认纯化效果→合并目的蛋白，透析→合并目的蛋白