沉淀反应与凝集反应

第十章沉淀反应与凝集反应第一部分凝集反应第二部分沉淀反应第一部分凝集反应第一节凝集反应的特点第二节直接凝集反应第三节间接凝集反应第四节自身红细胞凝集试验第五节抗球蛋白试验一、凝集反应定义细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗粒性抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象。参与凝集反应的抗体有IgM和IgG,IgM的凝集作用比IgG大数百倍。第一节凝集反应的特点二、反应阶段抗原抗体的特异性结合出现肉眼可见的凝集现象三、特点该方法简便、敏感度高，应用广泛。四、类型按抗原的性质和反应方式的不同分为：直接凝集和间接凝集直接凝集反应(directagglutination)：颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。第二节直接凝集反应（一）玻片凝集试验（二）试管凝集试验+（一）玻片凝集试验•方法评价:定性试验，简便和快速；敏感度低。•临床应用:菌种鉴定；血清学分型；血型鉴定。在试管内颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。（二）试管凝集试验•方法评价：半定量试验；简便、快速；敏感度低；可有假阳性。•应用：测定相应抗体的效价；可作临床诊断或流行病学调查。试管凝集试验根据凝集程度记录为：＋＋＋＋（100％凝集）、＋＋＋（75％凝集）、＋＋（50％凝集）、＋（25％凝集）。以出现50％凝集以上的血清最大稀释度为该血清的凝集效价。间接凝集反应(indirectagglutination):将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面，然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。第三节间接凝集反应1.正向间接凝集试验2.反向间接凝集试验3.间接凝集抑制试验4.协同凝集试验一、间接凝集反应的类型用抗原致敏载体--检测抗体1.正向间接凝集试验2.反向间接凝集试验用抗体致敏载体----检测抗原3.间接凝集抑制试验用抗原致敏载体--检测抗原4.协同凝集试验协同凝集反应与间接凝集反应的原理相类似，但所用载体既非天然的红细胞，也非人工合成的聚合物颗粒，而是一种金黄色葡萄球菌。它的菌体细胞壁中含有A蛋白SPA具有与IgG的Fc段结合的特性，因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体。如与相应抗原接触，即出现反向间接凝集反应。协同凝集反应也适用于细菌的直接检测。二、间接血凝试验1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024Pos.Neg.Titer648512232128324Patient12345678反向间接血凝试验血凝试验强度三、胶乳凝集试验•孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增高。•反之，非孕妇尿中HCG含量甚微，不能消耗掉抗HCG抗体。将待检血清或抗原和致敏乳胶各滴一滴在玻片上，阳性者5～10min即出现凝集。如妊娠免疫诊：四、明胶凝集试验将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明胶颗粒上，当致敏颗粒与样品血清作用时，若血清含有抗病毒抗体则可形成肉眼可见的粉红色凝集。五、间接凝集反应的应用一）抗原的检测反向间接凝集试验可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。二）抗体的检测检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体。未经致敏的受检者新鲜红细胞试剂：抗人O型红细胞的单克隆抗体临床应用：HIV检测、HBV检测第四节自身红细胞凝集试验自身红细胞凝集试验抗球蛋白试验又称Coombs试验第五节抗球蛋白试验（一）直接Coombs试验检测红细胞上抗体或不完全抗体单价抗体只能与一方抗原的抗原决定簇结合，不产生凝集反应，当加入抗球蛋白抗体后，可以将两个各连接一方抗原决定簇的单价抗体连接起来，出现凝集现象。（二）间接Coombs试验检测血清中的抗红细胞抗体临床应用：•在输血上的应用；•血型抗原抗体的检查；•对新生儿溶血性贫血性疾病的诊断；•对溶血性贫血的研究；•对细菌或立克次体的不完全抗体检查。第一节沉淀反应的特点第二节液体内沉淀试验第三节凝胶内沉淀试验第四节免疫电泳技术第二部分沉淀反应1.沉淀反应（precipitation）:是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象,其特性与经典的抗原抗体反应相同。第一节沉淀反应原理及特点2.沉淀反应分两个阶段第一阶段：抗原抗体特异性结合，快速但不可见。第二阶段：形成肉眼可见的大的免疫复合物。•免疫浊度测定•絮状沉淀试验•单向扩散试验•双向扩散试验•对流免疫电泳•火箭免疫电泳•免疫电泳•免疫固定电泳①液体内沉淀试验②凝胶内沉淀试验③凝胶免疫电泳技术3.沉淀反应的类型絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。方法受抗原抗体比例的影响非常明显应用于测定抗原抗体反应的最适比例三种类型：①抗原稀释法：抗原最适比例②抗体稀释法：抗体最适比例③方阵滴定法：抗原抗体最适比例一、絮状沉淀试验第二节液体内沉淀试验抗体稀释度抗原稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/640对照1/5++++++++++++±—1/10+++++++++++++—1/20+++++++++++++—1/40—±+++++++++—1/80————+++—最适比例方阵测定法二、免疫浊度测定1.原理当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。2.影响因素①抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量②抗体的质量:特异性强，效价高，亲和力强。③抗原抗体反应液的最适PH:为6.5～8.5可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。第三节凝胶内沉淀试验一、原理二、方法1、单向扩散试验（平板法）原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。可以定量。技术要点：将抗体混入0.9%琼脂糖内（50℃），未凝固前倾注成平板，凝固后打孔（直径3～5mm），孔中加入抗原溶液和不同浓度的标准品，置湿盒内37℃,24～48h观察孔周围是否出现沉淀环。倾注平板打孔加样放置37℃24～48h观察沉淀环单向扩散试验（平板法）影响因素：－抗体质量－标准曲线，质控血清－结果与真实含量不符－双环现象（不同扩散率抗原性相同的两个组分）上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右2为异常病理血清2、双向扩散试验（平板法）原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在3～5mm之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒37℃18～24h后，观察孔周围是否出现沉淀环。应用a.抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计；b.抗原或抗体相对分子量的估计;c.抗原性质的分析;d.抗体效价的滴定;e.抗原或抗体纯度的鉴定。优点：1.加快反应的速度。2.提高了灵敏度。3.增加了分辨率。抗原抗体反应的高度特异性电泳技术的高分辨率、快速、微量第四节免疫电泳技术电泳分析＋沉淀反应原理：双向扩散+电泳比双向扩散试验灵敏度提高8∼16倍技术要点：制备1.2%巴比妥琼脂凝胶板，在其上成对打孔，孔径3mm，孔距6mm，于阴极侧孔内加待测血清，阳性侧孔加抗血清，电泳。一、对流免疫电泳－蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动抗体球蛋白带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动＋对流免疫电泳通电结果分析：•无沉淀线出现则表明无相应的抗原。•沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。•沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度。对流免疫电泳电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。二、火箭免疫电泳1.原理：单向免疫扩散＋电泳，定量检测技术2.技术要点：1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧，6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。3.影响因素：琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则;电泳终点时间的确定;标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形;IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用。火箭免疫电泳图①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本-+三、免疫电泳一）原理：区带电泳＋双向扩散。1、蛋白质抗原在电场中，由于迁移率（取决于其分子量的大小和所带净电荷的多少）不同，其泳动速度不同，将复合蛋白质在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带。2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散。二）技术要点：制备琼脂板，打孔，加样于孔内，电泳2～3mA/cm，0.5～1h后，槽内加入相应抗血清作双向扩散。三）影响因素①抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比;②抗血清的抗体谱，混合抗血清的使用;③电泳条件直接影响分辨率。四）应用纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋的识别与鉴定1.什么是沉淀反应？2.沉淀反应的特点？3.单向扩散试验的原理和应用？4.什么叫直接凝集反应，什么叫间接凝集反应？它们之间有何异同？5.叙述间接血凝试验的原理。思考题