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退出目录课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数退出目录课前预习导学目标导航学习目标重点难点1.说明选择培养基的用途和配制要求。2.进行微生物的选择培养和样品中微生物数量的测定。重点:对土样的选取和选择培养基的配制。难点:对分解尿素的细菌数量的计数。退出目录预习导引一、研究思路1.课题背景尿素是一种重要的氮肥,但农作物不能(能、不能)直接吸收利用,而是首先通过土壤中的细菌将尿素在脲酶的催化下分解为氨之后,才能被植物吸收。2.筛选菌株微生物筛选的原理:人为提供有利于目的菌株生长的条件,同时抑制或阻止其他微生物生长,如可从热泉中将Taq细菌筛选出来。退出目录预习交流1——为筛选菌株而配制的培养基有何特点?筛选菌株所用的培养基具有能满足需筛选微生物正常生长所需的营养物质或条件,而不利于非筛选微生物的生长。此类培养基可通过哪些方法来实现其选择作用?提示:(1)在培养基中加入某种化学物质。例如,加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌;加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在培养成分的基础上加入。退出目录(2)改变培养基中的营养成分。例如,缺乏氮源时可以分离固氮微生物;石油作为唯一碳源时,可以分离出能消除石油污染的微生物;缺乏碳源时可以分离自养微生物。(3)改变微生物的培养条件。例如,将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物。退出目录3.统计菌落数目(1)测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。(2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目①为了保证结果准确,一般设置多于3个平板,选择菌落数在30~300的平板进行计数,并取平均数。②统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,因此,统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。4.设置对照设置对照的主要目的是比照实验组,排除其他因素的干扰,证明确实是所测试的条件引起相应的结果。退出目录二、实验设计1.实验设计的内容实验设计包括对实验方案,所需仪器、材料、用具和药品,具体的实验步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。2.土壤中的微生物土壤中的微生物主要分布在距地表3~8cm的近中性土壤中,约70%~90%为细菌。3.样品的稀释因为不同微生物在土壤中含量不同,为保证获得菌落数在30~300之间,适于计数的平板;细菌稀释倍数为104、105、106,放线菌稀释倍数为103、104、105,真菌稀释倍数为102、103、104。退出目录4.微生物的培养不同种类的微生物,往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30~37℃的温度下培养1~2d,放线菌一般在25~28℃的温度下培养5~7d,霉菌一般在25~28℃的温度下培养3~4d。在菌落计数时,每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果,以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。5.菌落的特征菌落的特征包括菌落的形状、大小、隆起程度、颜色等方面。退出目录预习交流2——菌落对应生命系统的哪一层次?由一个细菌通过细胞增殖而形成的肉眼可见的子细胞群体叫做菌落。(1)构成菌落的单个菌体和菌落分别对应生命系统的哪一层次?提示:1个菌体对应生命系统的细胞层次和个体层次;1个菌落对应生命系统的种群层次。(2)构成同一个菌落的细菌遗传物质有何特点?提示:如不考虑基因突变,构成同一个菌落的细菌应具有相同的遗传物质,因为细菌的增殖方式不是减数分裂,不发生遗传基因的重组。退出目录(3)如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌株数?提示:统计某一稀释度下平板上的菌落数,最好统计3个平板,计算出平板菌落数的平均值,然后按公式:每克样品中的菌株数=(C/V)×M进行计算,其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。退出目录三、操作提示和结果分析与评价1.操作提示(1)取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。(2)应在火焰旁称取土壤。将称好的土样倒入盛有无菌水的锥形瓶中,塞好棉塞。(3)在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁操作。(4)实验时要对培养皿做好标记,注明培养基类型、培养日期、平板上培养样品的稀释度等。退出目录2.结果分析与评价(1)在细菌分解尿素的化学反应中,细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强,pH升高。因此,我们可以通过检测培养基pH的变化来判断该化学反应是否发生。(2)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养某种细菌后,如果该细菌能够分解尿素,则pH升高,指示剂将变红。退出目录课堂合作探究问题导学一、研究思路活动与探究11.寻找目的菌株的思路是什么?提示:根据目的菌株对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找。退出目录2.阅读教材第22页第一段旁栏中的相关内容,并思考回答下列问题。(1)在培养基的配方中,为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质?琼脂的作用是什么?提示:碳源主要是葡萄糖,氮源是尿素。琼脂的作用是作为凝固剂。(2)该培养基对微生物是否具有选择作用?如果具有,是如何进行选择的?提示:该培养基对微生物有选择作用。该培养基的氮源比较特殊,是尿素,只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。(3)该培养基属于何种类型?提示:该培养基属于固体培养基,又属于选择培养基。退出目录3.样品中微生物数量的统计思路是什么?提示:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计培养基上的菌落数可推知样品中的活菌数。4.用活菌计数法统计菌落数时,为什么统计的菌落数比活菌的实际数目低?提示:因为对细菌接种时存在两个或多个细胞相连现象,当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。退出目录5.统计菌落数目时,选择具有多少菌落数的平板进行计数?教材中第22页楷体字部分所列举的两位同学对菌落数的统计,哪位同学的结果更接近真实值?他们的实验需要改进吗?如果需要,如何改进?提示:统计菌落数目时,一般选择数目为30~300的平板进行计数,目的是保证结果准确。两位同学的结果都不太接近真实值,他们的实验都需改进。两位同学都需要重新实验,实验时要至少设置3个组别,选择菌落数为30~300的平板计数并且求平均值。退出目录迁移与应用1用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数,在对应稀释倍数为106的培养基中,得到以下几种统计结果,正确的是()。A.涂布了一个平板,统计的菌落数是230B.涂布了两个平板,统计的菌落数是215和260,取平均值238C.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是21、212和256,取平均值163D.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是210、240和250,取平均值233退出目录解析:在设计实验时,一定要涂布至少3个平板,作为重复组,才能增强实验的说服力与准确性,所以A、B两项不正确。C项虽涂布了3个平板,但是,其中1个平板的计数结果与另两个相差太远,说明在操作过程中可能出现了错误,因此,不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。因此,正确答案为D。答案:D退出目录统计菌落数目的方法显微镜直接计数法间接计数法(活菌计数法)原理利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌退出目录操作方法(1)用计数板计数时,先将待测样品制成悬液。(2)取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。(3)根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数(1)设置重复组,增强实验的说服力与准确性。(2)为了保证结果准确,一定要选择恰当的稀释度。(3)选择菌落数在30~300的平板计数,并计算平均值缺点不能区分死菌与活菌,难以计数微小的细菌。不适于对运动细菌的计数;需要相对高的细菌浓度只能计活菌数,受稀释度影响很大退出目录二、实验设计活动与探究21.阅读教材中第22~23页“(三)设置对照”内容中的楷体字部分,请帮助A同学设置对照实验,以排除其他同学所质疑的可能影响实验结果的因素。提示:另增加两个组别:一个不进行接种,但培养条件和其他组别完全相同,以排除培养基被杂菌污染的可能;一个接种不能以尿素为氮源的微生物,培养条件和其他组别完全相同,以排除培养基中混入了其他含氮物质的可能。退出目录2.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度?提示:土壤中各类微生物的数量(单位:个/kg)是不同的,如在干旱土壤中的上层样本中:好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万,放线菌数约为477万,霉菌数约为23.1万。因此,为获得不同类型的微生物,就需要按不同的稀释度进行分离,同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。退出目录3.决定样品稀释度的因素是什么?一般而言,测定细菌、放线菌和真菌数量所选择的稀释度分别是多少?提示:决定样品稀释度的主要因素是样品中要测定的微生物的数量,数量越多稀释度应越大。由于细菌菌体小、繁殖快、数量多,所以稀释度一般较大,为104~106;放线菌为103~105;真菌菌体大、繁殖慢、数量少,稀释度一般较小,为102~104。退出目录4.在对菌落计数时,为什么要每间隔24h统计一次菌落数目?提示:菌种中有些菌体增殖快,有些菌体增殖慢,所以培养时间要充足,使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。并且选取菌落数目稳定时的数据作为结果,以防止因培养时间不足而遗漏某些菌落。5.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是什么?提示:将一定体积的水用细菌过滤器过滤后,将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养,大肠杆菌菌落呈现黑色,通过计数得出水样中大肠杆菌的数量。退出目录迁移与应用2下列关于微生物分离和培养的有关叙述,错误的是()。A.微生物培养前,需对培养基进行消毒B.测定土壤样品中的细菌数目,常用菌落计数法C.分离土壤中不同的微生物,要采用不同的稀释度D.分离能分解尿素的细菌,要以尿素作为培养基中唯一的氮源解析:微生物培养前,需对培养基进行灭菌处理,要将所有的微生物杀死;当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌;土壤中各类微生物的数量是不同的,为获得不同类型的微生物,就需要按不同的稀释度进行分离,同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。答案:A退出目录1.“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验步骤土壤取样(从肥沃、湿润的土壤中,用无菌小铁铲铲去表层土,迅速取土壤并装入无菌信封密封)制备培养基(准备选择培养基)样品的稀释(在火焰旁称取土壤10g,放入盛有90mL无菌水的三角烧瓶中,振荡使土样与水充分混合,将菌分散。制成10倍土壤稀释液,用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中,吹吸三次,使其充分混匀,制成102倍土壤稀释液,以此类推制成103、104、105、106倍土壤稀释液)退出目录取样涂布(在上述培养基的9个平板底面,每三个一组分别用记号笔写上104、105、106倍的三种稀释液,然后用三支1mL无菌吸管分别由104、105、106倍的三管土壤稀释液中吸取0.1mL对号放入已写好稀释度的平板中,用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀)退出目录培养观察(将培养基平板倒置于30~37℃温室中培养1~2天,每隔24小时统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果,算出同一稀释度的三个平板上的菌落平均数)退出目录2.实验注意事项(1)建立“无菌观念”,整个实验操作过程要严格无菌操作:实验器材、工作台、实验者、空气都要严格消毒灭菌,包括取土样的小铁铲和盛土样的信封使用前也要灭菌。(2)称取、稀释都要在酒精灯火焰附近的无菌环境中进行。(3)规范操作,实验结束后一定要洗手、消毒,以防被致病微生物感染。退出目录3.结果分析与评价内容现象结论有无杂菌污染的判断未接种的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目选择培养基具有筛选作用样品的稀释操作得到2个或2个以上菌落数目在30~300的平板操作成功重复组的结果若选择同一种土样,统计结果应接近退出目录当