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1高二生物学案专题1§1.2基因工程的基本操作程序一、学习导航1．知识网络目的基因：指编码蛋白质结构基因基因组文库从基因文库中获取目的基因部分基因文库原理：目的基因的获得方法前提条件：利用PCR技术扩增目的基因过程：特点：人工合成目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，并使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的构建目的基因（基因工程的核心）基因表达载体的组成：启动子终止子标记基因转化：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞导入植物细胞的方法：基因枪法花粉通道法方法：导入动物细胞的方法：显微注射技术导入微生物的方法：Ca2+检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因方法：分子杂交技术（DNA探针+转基因生物DNA）目的基因的检测和鉴定检测目的基因是否转录方法：分子杂交技术（DNA探针+转基因生物mRNA）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：抗原—抗体杂交鉴定：对生物进行个体水平的鉴定2．学习目标简述基因工程原理及基本操作程序。3．重难点学习重点：基因工程基本操作程序的四个步骤。2学习难点：(1)从基因文库中获取目的基因。(2)利用PCR技术扩增目的基因。二、自学评价基因工程的基本操作程序主要包括4个步骤：的获取、基因表达的构建、将细胞、的检测与鉴定。（一）目的基因的获取1、概念：目的基因主要是指编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子。2、来源：（1）可以从自然界中已有中直接分离出来。（2）从中获取目的基因。3、基因文库：（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多片段导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。（2）种类：基因组文库――含有一种生物的。部分基因文库――含有一种生物的。（如cDNA文库）4、获取目的基因的方法：（1）从基因文库中获取目的基因根据目的基因的有关信息，如根据基因的序列，基因的功能、基因在上的位置、基因的转录产物，以及基因的表达产物等特性来获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因：①原理：PCR技术是一项在生物体外复制片段的核酸合成技术。②前提条件：提供已知的核苷酸序列，根据这段序列合成。③过程：目的基因DNA变性形成DNA单链，与结合，然后在的作用下延伸形成DNA。④特点：扩增，即2n(n为扩增循环次数)。（3）人工合成方法：当基因较小，核苷酸序列已知时，可以用人工方法合成（例如，通过直接合成）。（二）基因表达载体的构建1、表达载体的组成表达载体：目的基因、、、标记基因。启动子：它是一段有，位于基因的首端，它是的识别和结合部位，驱动转录mRNA。终止子：位于基因的尾端，终止过程。标记基因：用于受体细胞是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。2、构建表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中存在，并且给下一代，同时使能够表达和发挥作用。（三）将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法：①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和3表达的过程，称为。②农杆菌特点：在自然条件下能感染植物和植物，对植物没有感染力。Ti质粒的可以转移至受体细胞，并整合到受体细胞的上。（2）基因枪法又叫。（3）花粉管通道法：利用花粉管通道使目的基因借助进入。2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：。（2）操作程序：目的基因的提纯→取卵（受精卵）→→移植输卵管或子宫内→新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物的特点：，。（2）转化：用处理细胞→细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收分子，完成转化。（四）目的基因的检测与测定1、检测：①检测转基因生物的染色体DNA上的，原理是技术。②检测目的基因是否转录出，原理是技术。③检测目的基因是否翻译成蛋白质，原理是。2、鉴定：个体生物学水平鉴定，如抗虫、抗病鉴定等。三、知识拓展1、原核细胞基因结构（1）编码区和非编码区能编码蛋白质的区段叫做编码区；不能编码蛋白质的区段叫做非编码区，在非编码区上有调控遗传信息表达的核苷酸序列。（2）2、真核细胞的基因结构（1）外显子和内含子外显子能编码蛋白质，内含子不能编码蛋白质。（2）非编码区和非编码序列非编码序列包括非编码区和编码区的内含子。4一个典型的真核细胞基因结构示意图(3)原核细胞的基因结构与真核细胞的基因结构的异同点原核细胞的基因真核细胞的基因不同点编码区连续；结构简单编码区有间隔，不连续；结构复杂相同点都有编码区和非编码区；编码区都有调控遗传信息表达的核苷酸序列；编码区上游都有与RNA聚合酶结合的位点3、原核生物和真核生物的转录原核生物的编码区转录为相应的mRNA；真核生物的转录为初级mRNA，接下来内含子转录的部分被切割掉，使外显子转录的部分连接起来才能成为成熟的mRNA。5§1.1重组技术的基本工具（一）思考与探究1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：(1)…CTGCA(2)…AC(3)GC……G…TGCG…（4）…G(5)G…(6)…GC…CTTAAACGTC……CG(7)GT…(8)AATTC…CA…G…你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？答：2和7能连接形成…ACGT……TGCA…；4和8能连接形成…GAATTC……CTTAAG…；3和6能连接形成…GCGC……CGCG…；1和5能连接形成…CTGCAG……GACGTC…。2.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。3.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。4.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？提示：迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。（二）寻根问底1.根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。2.DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？6答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。（三）模拟制作讨论题1.你模拟插入的DNA片段能称得上一个基因吗？提示：不能。因为一般基因有上千个碱基对。2.如果你操作失误，碱基不能配对。可能是什么原因造成的？提示：可能是剪切位点或连接位点选得不对（也可能是其他原因）。（四）旁栏思考题想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？提示：能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点及对受体细胞无害等。§1.2基因工程的基本操作程序（一）思考与探究1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T