肿瘤体外药敏检测(完整)

TumorChemosensitivityAssay肿瘤体外药敏检测技术进展及应用广西医科大学外科实验室苏承武☆肿瘤化疗药物敏感性试验是个体化治疗的基础肿瘤化疗药物敏感性试验(TCA)TumorChemosensitivityAssay将肿瘤细胞进行体外的有药培养，然后通过检测细胞活性的有关指标，判断不同药物的疗效。通过这种试验，即可确定针对个体肿瘤细胞具有最佳疗效的化疗药物或药物组合。1.肿瘤细胞的异质性(heterogeneity)肿瘤的发生具有多阶段、多基因的特点，而同一种肿瘤的基因特性和发生阶段都可能会有非常大的差别；表现出在形态上和生物学功能上的极大的不同。这种肿瘤细胞的异质性已经得到越来越清楚的认识。肿瘤细胞的异质性主要表现在形态异质性：病理学上的形态多种多样。基因异质性：肿瘤的发生经历了多基因的改变，同一种基因可以有多个突变位点。如P53基因的突变位点就已发现有2000个之多。功能异质性：基因的异质性导致生物学功能的异质性。左：肠型腺癌(胃)右：弥漫型胃癌2.临床与个体化治疗化疗作为全身性治疗的手段，在恶性肿瘤的治疗中具有不可替代的地位。同种肿瘤对化疗药物具有不同的反应性，忽视个体差异仅凭经验式化疗存在盲目性，使得总体疗效不佳。尤其对实体瘤，经验化疗的疗效仅为20％左右。临床需要切实可行的检测方法，在用药前筛选出敏感药物，以进行针对性较强的个体化治疗；是否进行个体化治疗成为肿瘤化疗能否成功的关键因素。050100150200250020406080100ATP-TCA指导的化疗(n=39)传统化疗(n=17)p=0,0009Weeks%Patients050100150200250020406080100ATP-TCA指导的化疗(n=39)传统化疗(n=17)p=0,0016Weeks%PatientsOverallSurvivalProgressionfreeSurvival引自KurbacherCM,CreeIA,Brucker.AnticancerDrugs.1998,9:51-57传统化疗和ATP-TCA指导的化疗的生存率比较☆肿瘤化疗药敏方法发展及简介化学治疗是肿瘤的三大治疗手段之一。近30年来，虽然某些恶性肿瘤的化学治疗有明显改善，但多数肿瘤，特别是实体瘤疗效仍不理想。这与肿瘤存在个体差异性，以及多重耐药性（MDR）等因素有关。因此如何选择有效药物，进行有的放矢的治疗早已成为化疗界所关注的问题。早在上世纪60年代已有报告，用卵巢癌组织进行药敏检测，该组病人中位生存期有明显延长。化疗药敏检测已发展成为体外（invitro）与体内（invivo）两类，成为“当今癌症研究的主攻课题”之一。理想的药敏检测方法应该具备的条件1.操作简便，可以标准化，便于推广2.标本可评价率高3.检测敏感、可靠、客观4.临床相关性肿瘤化疗药敏方法发展创新方向1.标准化，精确定量（无论是用药量或细胞数等）2.对体内环境的极近模拟一、体外药敏检测（一）瘤细胞直接损害试验新鲜肿瘤标本制成单细胞悬液，与抗癌药接触1～数小时后，洗去抗癌药，加入染色剂，与未加药对照样本比较，可从瘤细胞的杀伤比例判断药物抗肿瘤效应。根据染色剂与观察指标的不同，可分为：美兰法、伊红台盼蓝法、吖啶橙荧光测定法、同位素释放法等。上述试验周期短、成本低、方法简便，但准确性差，现已少用或仅作为细胞存活与否的判断方法。（二）原代瘤细胞培养体外药敏预测一般采用短期原代培养。在无菌条件下，用机械法和／或酶消化法，将新鲜肿瘤标本分离为组织块、细胞团或分散的单个细胞（视瘤组织多寡及所用培养方法而定），与各种抗癌药分别作用一定时间后，与对照组比较，可计算用药组的瘤细胞杀伤比例，测出抗癌药物敏感度。主要的原代瘤细胞培养药敏检测方法及其存在的问题药敏检测方法存在问题集落形成法（HTCA）标本可评价率低，仅有40~70％。实验周期长，需要2周以上测试药物种类和数量有限操作繁琐，难以标准化阳性预测值较低，仅有40～60％四唑蓝比色法(MTT)敏感性较差，最低仅能检测500个细胞量程较小，有效量程在2.0以内细胞毒性差异染色法(DiSC)可适用标本类型不广，目前仅用于血液肿瘤人为判断因素较大，难以推广标本可评价率不高，仅有70～80％阳性预测值较低，仅有70～80％胸腺嘧啶核苷掺入法(3H-TdR)实验人员接触放射，不利于健康标本可评价率不高，仅有70～80％测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞对某些药物的测试结果存在假阴性原代瘤细胞培养药敏检测方法的几点提示本类方法在与其他学科的结合中仍在不断探索发展，并无完美及完全定形的技术，各方法内部尚有细化及改进方法。肿瘤细胞贴壁法、瘤细胞粘附培养法、细胞团培养法及流式细胞仪测定法等已成为细胞分子生物学技术手段，不再作为独立的药敏检测方法。一些相对简便经济的方法在目前仍应积极提倡，如MTT比色法。（三）同步瘤细胞培养将处于不同细胞周期的瘤细胞分离培养，可研究药物的周期特异性作用。1.药物阻断法如长春新碱使细胞阻滞于M期，博莱霉素则使其堆积于G2期。2.物理法运用细胞同步化技术，如M期细胞震荡收集法，可避免药物阻断法的干扰作用。（四）瘤细胞连续培养瘤细胞培养一定时间后（通常为1～4周），细胞生长增殖达到一定密度，产生密度抑制。故需分离出一部分细胞，进行传代培养，并可建立细胞株。本法得到的瘤细胞数量多，在抗癌新药筛选中起重要作用。缺点是实验周期长，只能作回顾性药敏检测。二、体内药敏检测即异种移植法。通常用啮齿类动物做移植宿主。将人癌标本移植于受试动物体内如肾包膜下移植法（SRCA），再给予抗癌药。数天至数周后处死动物，测量移植瘤的大小变化，以评定药物敏感度。本法较体外试验更接近人体情况，对需要体内代谢而发挥作用的药物，如临床常用的环磷酰胺尤为适宜。还可测试联合化疗方案的疗效，临床意义较大。体外试验与体内试验可交替应用。如将体外培养的瘤细胞植入裸鼠体内，或将人癌移植瘤再作HCTA培养均可。☆几种原代瘤细胞培养药敏检测方法简介一、MTT比色法四氮唑化合物MTT（Methylthiazolyltetrazolium）在活细胞线粒体酶作用下可裂解为紫蓝色不溶性的甲臜化合物（Formazan），加入异丙醇或二甲基亚砜后，用分光光度计（酶标仪）测出其光密度变化。本法简单迅速，操作可半自动化。缺点是不能区分正常细胞与肿瘤细胞，此外对于不同类型的肿瘤标本可能需要不同的细胞浓度与药物作用时间。故有待进一步改进。目前已有药物梯度浓度的引入。二、ATP-TCAATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术原理：在有氧条件下,荧光酶（luciferase）可以催化荧光素（luciferin）释放出荧光（波长为562nm），同时ATP转变成AMP。所释放的荧光强度与胞内ATP含量呈正相关。细胞死亡后，胞内ATP迅速水解，而活细胞的ATP含量基本恒定。因此所测得的荧光强度反映了活细胞的数量。比较药物系列浓度对培养细胞的不同抑制率，参照相应判断指标，从而可以评估该化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果。ATP+Luciferin+O2AMP+2Pi+Photons+OxylaluciferinLuciferase荧光强度与活细胞数量的关系1001000100001000001000000100000001020408015831262512502500500010000200004000080000细胞数量(个/孔）荧光强度(RLU)r＝0.9986技术流程TumorSingleCellsuspensionMechanicalandenzymaticaldissociationIncubationfor3-5daysAdditionofdrugs/mediumATP-LuminescenceATPextractionandstabilizationSoftwareEvaluationConstructionofdose-responseplots国内外研究历史回顾1.1982年，Moyer等首先提出内源性ATP的含量可以反映细胞活性;随后Kangas等相继证实生物荧光技术是一种敏感、可靠的确定各种细胞活性的检测方法。2.自1988年，Sevin首先将此方法用于新鲜肿瘤组织的药敏检测，在欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。3.1998年，Kurbacher等人报道了ATP-TCA辅助化疗与传统化疗比较的临床Ⅱ期试验结果，试验结果表明，ATP-TCA指导的化疗治疗复发性卵巢癌较传统化疗模式更能提高临床疗效，延长病人总生存期和无进展生存期。4.NIH的GOG(GynecologicOncologyGroup)项目组认为ATP-TCA是最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目(1998)。目前先进国家对该技术的评价1.1998年德国DCS公司将该技术产业化，并获得国际ISO质量评估体系认证，在欧洲和北美市场获得准入。2.2001年，美国全国医疗保险协会(HealthMaintenanceOrganization)认为，该技术是一项精确和可靠的并能指导医生选择用药的先进技术，建议在全美进行医疗保险赔付。目前在加州等15个州已获医疗保险赔付。3.2003年日本厚生省和保险联合会也认为，该技术是一项先进的临床医学项目，该技术指导的肿瘤化疗较传统的化疗方案更能明显提高胃肠道肿瘤的治愈率，建议该项技术在全国范围内获得医疗保险赔付。ATP-TCA技术是目前最先进的体外药敏技术，该技术敏感可靠，具有极大的临床应用价值主要试剂仪器ATP-TCA核心试剂盒（德国DCS）：包括完全分析培养基（CAM）、最大ATP抑制剂、组织消化酶液、ATP提取液、荧光素-荧光素酶（lulu）、ATP标准品、无菌96微孔培养板。自发光分析仪（德国Berthold）、超净工作台ATP-TCA技术的核心试剂◎.荧光酶试剂(luciferin-luciferasecountingreagent)热稳定性和发光效率均好的重组酶试剂保证检测的敏感性和可靠性，满足临床实际工作的需要◎.培养基(completeassaymedium)肿瘤细胞选择性培养基支持肿瘤细胞生长增殖，促进正常细胞死亡，从而保证药敏检测的肿瘤细胞特异性培养前后细胞组成变化培养前细胞组成3-5天培养后细胞组成淋巴上皮成纤维肿瘤淋巴上皮成纤维肿瘤细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞40-50%10-25%5-10%10-20%1%10%10%80%选择性培养基的研究结果表明该培养基具有良好的选择性，适合肿瘤体外药敏检测的需要ATP-TCA药物测试方式实验过程实体瘤（也可以是穿刺样品或腹水等液体样品）先被切碎，并用酶分离成细胞悬液。这一过程并不影响肿瘤细胞的活性。将细胞悬液加入到含有浓度不同的化疗药物的无血清培养基（CAM）中，在培养基板中培养3-5天。CAM培养基可以抑制非瘤细胞的生长，选择性培养肿瘤细胞。培养后，加入可以稳定细胞内ATP的提取试剂，提取出ATP。加入荧光素-荧光素酶系统，在板式发光分析仪上进行ATP的检测。根据含药孔的荧光值与无药孔（M0）的荧光值的比较，得出该浓度化疗药物对肿瘤细胞的抑制值。做出化疗药物的剂量-抑制曲线，得到AUC值、IC90、IC50以及敏感度指数SI值，判断化疗药物的敏感度。剂量-抑制曲线评价标准强敏感(SS)：IC5025%及IC90100%PPC中度敏感(IS)：IC5025%及IC90100%PPC轻度敏感(MS)：IC5025%及IC90100%PPC耐药(R)：IC5025%及IC90100%PPC化疗药物敏感性分析：下列指标可以说明药物的敏感性和耐药性高AUC，低IC50,IC90,SI值，和高TGI值，显示100％肿瘤细胞生长抑制，药物的敏感性就高。低AUC，高IC50,IC90,SI值，和低TGI值，表示对药物的高耐药性。三、组织培养药物敏感性检测技术HistocultureDrugResponseAssay(HDRA)H