胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)的建立及临床应用研究

中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文-1-论文题目胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)的建立及临床应用研究研究生：梁智导师：张伟研究员学科专业：细胞生物学研究方向：药敏检测技术所在所院：肿瘤医院肿瘤研究所入学时间：2003年9月二零零六年五月中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文-2-目录缩略语表-----------------------------------------------------------1中文摘要-----------------------------------------------------------2英文摘要-----------------------------------------------------------4前言---------------------------------------------------------------6材料与方法---------------------------------------------------------9实验材料1.实验细胞系2.主要实验仪器3.主要试剂和耗材4.病人资料及肿瘤标本实验方法1.主要试剂的配制2.细胞的复苏与冻存3.不同培养条件对肿瘤细胞生长支持度的测定3.1.所用培养基对肿瘤细胞系生长支持度的测定3.2.所用培养基对原代肿瘤细胞系生长支持度的观察3.3.I型胶原蛋白包被对肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞生长支持度的观察中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文-3-4.胶滴肿瘤药敏检测（CD-DST）的建立4.1.利用肿瘤细胞系建立胶滴培养技术4.2.胶滴培养药敏技术的药物测试浓度4.3.原代肿瘤细胞的体外胶滴肿瘤药敏检测5.ATP-TCA法药敏检测结果--------------------------------------------------------------231.胶原包被对肿瘤细胞生长状态的影响2.所用培养基对肿瘤细胞生长支持度的动态观察3.肿瘤细胞在胶滴培养中生长状态的观察4.药物体外的杀伤作用5.图像的分析6.CD-DST法与ATP-TCA二种技术的相关性比较7.CD-DST法的标本可评价率8.肿瘤标本对化疗药物的体外敏感性讨论--------------------------------------------------------------35结论--------------------------------------------------------------45参考文献----------------------------------------------------------45文献综述----------------------------------------------------------45致谢--------------------------------------------------------------23中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文-4-缩略语表缩略语英文名中文名CD-DSTCollagengeldropletculturedrug-sensitivitytest胶滴肿瘤体外药敏检测技术ATP-TCAATPbioluminescenceexvivotumorchemosensitivityassayATP生物荧光肿瘤体外药物敏感性检测MTTMethylthiazoletetrazolium四唑蓝HTCAHumantumorclonogenicassay软琼脂克隆形成实验DiSCDifferentialstainingcytotoxicityassay差异染色细胞毒检测IC50Inhibitionconcentration50%杀伤50%肿瘤细胞所需药物浓度FBSFetalbovineserum胎牛血清ODOpticaldensity光密度值中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文-5-胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)的建立及临床应用研究中文摘要目的：建立胶滴肿瘤体外药敏检测技术，探讨其在肿瘤个体化治疗中应用的可行性。方法：用人类肿瘤细胞系建立胶滴肿瘤体外药敏检测技术；并用该技术对50例不同肿瘤类型的原代肿瘤标本进行药敏检测实验研究，其中包括妇科恶性肿瘤18例，胃肠道恶性肿瘤15例，白血病/淋巴瘤8例，肺癌5例，肝癌4例。每种肿瘤标本分别进行了4-5种包括阿霉素(ADM)、5-氟脲嘧啶（5-FU）、顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、紫杉醇（PTX）、草酸铂（L-OHP）和健择（GEM）等抗肿瘤药物的敏感性测定。结果：在体外成功建立了胶滴肿瘤药敏检测技术，并确定了胶滴肿瘤体外药敏检测技术的最佳条件；该技术与ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术（ATP-TCA）相比具有较好的相关性；该技术检测所需标本量小（3×103个细胞/滴）可扩大其应用范围；实验证实该技术可反映病人对不同抗肿瘤药物敏感性的差异；标本整体评价率为82.0%（41/50）；检测结果与临床经验有效率间有较好的符合性。结论：CD-DST法体外肿瘤药敏检测技术是一种较好的药敏检测方法，标本可评价率为82.0%（41/50），所需标本量小的特点使其扩大了在临床上的应用范围。该技术可反映病人对不同抗肿瘤药物敏感性的差异，检测结果与临床经验有效率有较好的符合性。因此该药敏检测方法对抗肿瘤药物筛选和对个体化治疗具有实际应用价值。该技术的建立填补了国内该领域的空白。关键词：肿瘤药敏检测胶滴肿瘤药敏检测技术中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文-6-TheEstablishmentofCollagengeldropletculturedrug-sensitivitytest(CD-DST)TechniquesandItsClinicalApplicationAbstractOBJECTIVE:ToestablishCollagengeldropletculturedrug-sensitivitytest(CD-DST)techniqueandexploreitsclinicalfeasibilityofapplication.METHODS:Thehumantumorcelllineswereusedtofindoutthebestcultureconditionsofcollagengeldropletculturedrug-sensitivitytest(CD-DST).Thechemosensitivityof4or5anticancerdrugs（ADM,DDP,MMC,PTX,L-OHP,GEM,5-FU,etc.）wasassessedbytheCD-DSTintheovariananduterinecancer（n=18）,gastrointestinalcancer（n=15）,lymphomaandleukaemia（n=8）,lungcancer（n=5）,livercancer（n=4）。RESULTS:Weestablishedthecollagengeldropletculturedrug-sensitivitytest(CD-DST)byusingthehumantumorcelllines.TheCD-DSTcanevaluatetheefficacyofanticancerdrugsindiversekindsoftumorspecimen,andhasgoodcorrelationwithotherchemosensitivityassaymethods.Furthermore,theCD-DSThastheadvantageofusingacomparativelysmallnumberofcells(3×103cell/30μl),whichcansolvetheissueofminorspecimensource.TheCD-DSTcanreflectthedifferencesofanticancerdrugssensitivityindifferentpatientswiththegoodclinicalcorrelationandanoverallpredictingvalueof82.0%（41/50）.CONCLUSION:Therewereconsiderabledifferencesin中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文-7-chemosensitivitybetweenindividuals.TheCD-DSTisagoodchemosensitivityassaymethodswiththeadvantageofhighoverallpredictingvalueandacomparativelysmallnumberofcells,sothatitcansolvetheissueofminorspecimensource.TherewasastatisticallycorrelationbetweenclinicallyreportedresponseratesandtheresponseratesobtainedbyCD-DST.Itappearstobeusefulinexploringthepossiblecombinationplotsandprinciples,evaluatingtheefficacyofexistingchemotherapy,andoptimizechemotherapyonanindividualbasis.Ourresearchalsofilledtheblankinthisfieldofourcountry.KeyWords:TumorChemosensitivityassayCD-DST中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文-8-胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)的建立及临床应用研究前言恶性肿瘤是一大类严重威胁人类生命和健康的疾病。化学治疗在恶性肿瘤综合治疗中占有越来越重要的地位，但目前化疗的疗效仍不理想。肿瘤本身存在着异质性，即便同一组织学类型，分化程度相同的肿瘤对同一药物的敏感性不同。例如胃癌患者的单药有效率仅为15%-30%，丝裂霉素（MMC）有效率为30%，氟尿嘧啶（5-FU）有效率为21%，表阿霉素（EDI）有效率为19%，联合化疗的有效率也仅为30%-50%[1]。由于化疗药物一般都具有较强的毒性，不当的化疗既给患者造成痛苦，又不能缓解病情，更重要的是有可能诱发多重耐药，导致治疗失败。因此如何更有效地筛选应用抗癌药，预测个体肿瘤对药物的敏感性，指导临床治疗以提高疗效早已成为临床化疗界瞩目的问题。近年来肿瘤药敏试验指导的个体化治疗的研究，受到国内外肿瘤界的重视。国际上相继建立了一系列体内、外药物敏感性试验技术。大量国外临床研究表明肿瘤体外药敏检测与临床疗效存在一定的相关性，体外药敏检测能够较好的指导临床用药，提高临床疗效以及延长病人的生存期[2-7]。因此为了提高疗效，减少不必要的毒副作用，防止多重耐药性的产生，有必要对肿瘤患者个体的药物敏感性进行测试,特别在目前抗癌药物日趋增多的形式下，帮助患者选择其中敏感药物，显得尤为重要。临床上迫切需要切实可行的检测方法进行药敏试验，以期制定最佳化疗方案，提高化疗疗效。理想的肿瘤原代细胞药敏体系的目标在技术层面上应该满足如下条件：(1)需要的肿瘤组织较少，不影响其他病理检查对肿瘤标本的需求。(2)实验结果成中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文-9-功评价率高；(3)具有较好的结果重复性；(4)体外实验结果与药物体内疗效有较好的符合率[8]。为了建立上述理想的药敏体系，人们对此进行了长期的实验探讨。目前，体外检测肿瘤对化疗药物敏感性的方法主要有软琼脂克隆形成实验（HTCA）〔9〕〔10〕、四唑蓝比色法(MTT)〔11〕〔12〕、差别染色细胞毒检测法(DiSC)〔1