鸡卵类粘蛋白的制备

综合实验报告书（2014~2015学年）实验题目鸡类卵粘蛋白的制备学院名称生物与食品工程学院专业（班级）生物工程11-2班姓名（学号）胡肖希20115971起讫日期2014年6月23日—2014年6月27日指导教师罗水忠2014年7月1日鸡类卵粘蛋白的制备生物工程11-2班学号：20115971姓名：胡肖希同组人员：孙禹摘要：参照Kassell的方法进行了鸡卵类粘蛋白的提取与制备，并使用核酸蛋白检测仪及紫外分光光度计检验了产物的纯度。实验结束后从鸡蛋中获得了鸡卵类粘蛋白。关键字：鸡卵类粘蛋白；Kassell法鸡卵类粘蛋白（chickenovomucoid，简称CHOM）是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，它具有抑制胰蛋白酶的作用，常用语胰蛋白酶的酶学性质的研究，也可将其制成吸附亲和剂，通过亲和层析技术有效地分离与纯化胰蛋白酶。鸡卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时迅速识货，鸡卵类粘蛋白除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无以至作用买另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。本实验主要参照Kassell的方法，先由鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）-丙酮溶液处理，除去沉淀，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，再经DEAE-纤维柱层析纯化而获得合格产品。1材料与方法1.1主要试剂与器材1.1.1主要试剂丙酮，10%pH1.15的三氯乙酸，0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液，0.5mol/L氯化钠-0.5mol/L氢氧化钠溶液，0.5mol/L盐酸溶液，0.3mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液，底物缓冲液：0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液（内含2.22mg/mL的氯化钙），2mmol/LBAEE底物：用底物缓冲液配制，DEAE-纤维素粉（DE-32），1mg/ml胰蛋白酶溶液：用底物缓冲液配制，SephadexG-251.1.2器材新鲜鸡蛋，pH计，布氏漏斗及抽滤瓶，透析袋，层析柱（35mm×200mm,35mm×300mm各1支），紫外分光光度计，核酸蛋白质检测仪，离心机，真空干燥器1.2鸡卵类粘蛋白的提取取50ml鸡卵清，加入等体积的10%pH1.15三氯乙酸溶液，在酸度计上检查pH值，用5mol/L氢氧化钠或5mol/L盐酸将pH调到pH3.5±0.2范围内，在室温下静置4小时以上。待卵清清蛋白完全沉淀后，以3000r/min离心10分钟。弃去沉淀物并过滤上清液，收集滤液转移到一个500mL烧杯内，将pH调回pH3.5。放置冰浴或冰箱内冷却片刻，缓慢加入3陪体积预冷的丙酮。用玻璃棒轻轻搅匀，封严，在冰浴里放置2到4小时左右，待鸡卵类蛋白完全沉淀后，小心虹吸出一部分上清液，剩余的部分全部转移到50mL带盖的离心杯内，盖上盖经平衡后以3000r/min离心15分钟，除去上清，离心杯底部的沉淀物放在真空干燥器内，抽气出去残留丙酮。待沉淀物由白色转变为透明粘稠物后停止抽气。加入20mL蒸馏水溶解，有不溶物则用滤纸滤去。滤液经SephadexG-25柱层析法脱盐或者经透析除盐。本实验采用SephadexG-25柱层析法脱盐，操作如下：称取30gSephadexG-25，用500mL0.02mol/L，pH6.5的磷酸盐缓冲夜在100℃热溶胀2小时或者室温下溶胀24小时。脱气后装柱（35mm×300mm），柱床体积约150mL。用约2倍体积的0.02mol/L,pH6.5的磷酸盐缓冲夜平衡。流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定放入基线或经紫外分光光度计测定光吸收，其A280小于0.02即可使用.取20mL鸡卵类粘蛋白提取液上柱，用同样的缓冲液洗脱，收集第一峰，在蛋白峰完全流出后盐才开始流出，盐通常在280nm无明显光吸收，若绘出第二峰则是残留丙酮峰。丙酮和盐同时流出。1.3鸡卵类蛋白的纯化通过上述方法获得的鸡卵类蛋白仍含有少量的卵清清蛋白。采用DEAE-纤维素离子交换层析可以将二者分开，从而达到分离纯化的目的。称取10gDEAE-纤维素粉（E-32），以150mol/L氯化钠溶液浸泡分钟。转移到布氏漏斗内抽滤。用蒸馏水洗至pH8.0左右，抽干。然后移至一个500mL的烧杯内，用150mL0.5mol/L盐酸溶液浸泡20分钟，在转移到布氏漏斗内抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，最后转移到烧杯内，用150mL0.2mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液浸泡约15分钟，经真空干燥器脱气后装柱。取一支层析柱装入约1/4体积的0.02mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液，将处理过的DEAE-纤维素装入柱内。以同一缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或经紫外分光光度计测定光吸收，待A280nm值小于0.02即可。将经SephadexG-25脱盐后的鸡卵类粘蛋白溶液上柱吸附。以0.02mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，待流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线后，改用0.3mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5的磷酸缓冲夜洗脱，收集第二洗脱峰。在鸡卵清清蛋白量很少时，可根据峰形大小，测定活性来确定鸡卵类粘蛋白洗脱峰的位置。1.4鸡卵类粘蛋白纯品的制备经DEAE-纤维素离子交换柱层析制得的鸡卵类粘蛋白溶液装入透析袋内，对蒸馏水进行透析，间隔一段时间更换一次蒸馏水，直至经1%硝酸银检查五氯离子为止。将透析过的鸡卵类粘蛋白溶液转移到烧杯内，小心地用1mol/L盐酸调节至pH4.0，取出1mL，稀释5到10倍测定鸡卵类黏蛋白的含量及活性。然后加入3倍体积的预冷丙酮，用塑料薄膜封严烧杯口，在冰浴里静置4小时左右。待鸡卵类粘蛋白完全析出后，倾出上清液，沉淀部分转移到一个带盖的50mL的离心杯内，于3000r/min离心15分钟，弃去上清，沉淀物放入真空干燥器内真空干燥，即可得到透明胶胶状物----鸡卵类粘蛋白（约200到300mg）。1.5鸡卵类粘蛋白的活性测定鸡卵类粘蛋白是胰蛋白酶的天然抑制剂，测定它的活性可以用抑制胰蛋白酶的活力单位来表示。即：抑制1个胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）所需卵类粘蛋白量定为抑制剂的1个活力单位。将卵类粘蛋白和结晶胰蛋白酶按一定比例相互混合（一般以1：2较适合），加入适量的0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液在25℃保温10分钟左右，使酶与抑制剂充分结合。然后取适量混合液按所述胰蛋白酶活力测定方法测出剩余酶活力，同时，取相同量的胰蛋白酶（未加抑制剂）按常规方法测出胰蛋白酶活力，由它减去剩余酶活力，即为被抑制的胰蛋白酶活力，也就是卵类粘蛋白的抑制活力。取2个石英比色池（带盖，光程为1cm），向一个碧色池内加入1.5mL的0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液和1.5mL的2.0mmol/LBAEE底物溶液，混匀，在波长253nm处调整仪器零点。向另一个比色池加1.5mL0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液，10微升胰蛋白酶，10微升鸡卵类粘蛋白轻轻摇匀，在室温下（最好是在25℃恒温箱内）放置2分钟，使胰蛋白酶与鸡卵类粘蛋白充分结合。然后加入1.5mL2mmol/LBAEE底物溶液，立即混匀并记时。于波长253nm处测定其光吸收递增值-----△A253nm/min。每隔30秒钟读数一次，使△A253nm/min值控制在0.05左右为宜，否则要根据△A253nm/min的大小适当减少或增加鸡卵类粘蛋白的量。以反应时间t为横坐标，△A253nm为纵坐标作图，取直线部分的任一时间间隔与相应的光吸收变化值△A253nm/min用A2表示。与此同时，以同样的方法（不加鸡卵类粘蛋白）测胰蛋白酶的活性。通过作图得到光吸收变化值△A253nm/min，用A1表示。鸡卵类粘蛋白的抑制活性及抑制比活性的计算公式如下：鸡卵类粘蛋白的抑制活性单位（BAEE）=（A1-A2）/0.001鸡卵类粘蛋白抑制比活单位（BAEE单位/mg胰蛋白酶）=1000（A1-A2）/(I×0.001)式中：A1为胰蛋白酶△A253nm/minA2为加入抑制剂后胰蛋白酶△A253nm/minI为测定时所用鸡卵类粘蛋白的量（微克）1000是将抑制剂的微克数转换成mg数0.001是指光吸收每增加0.001定义为1个BAEE单位1.6鸡卵类粘蛋白的含量测定配成一定浓度的鸡卵类粘蛋白溶液，在280nm处测定其光吸收。鸡卵类粘蛋白的消光系数是：A1%（1cm）=4.13式中1%为蛋白浓度（1g/100mL），当蛋白浓度为1mg/mL时，其消光系数为0.413.鸡卵类粘蛋白=A280nm×稀释倍数/0.4132结果与分析3讨论(包括心得体会)参考文献合肥工业大学姓名专业(班级)学号实验名称：个人自评（包括实验态度、出勤、纪律、收获与体会等）：组长（或学习委员）签字：年月日指导教师评定成绩：指导教师签字：年月日综合实验报告成绩评定