黄孢原毛平革菌的培养实验

黄孢原毛平革菌的培养实验关键词：显微镜三角瓶ATCC北京标准物质网一、黄孢原毛平革菌试验所用菌种黄孢原毛平革菌BKM-F-1767，密封，置于冰箱中。二、黄孢原毛平革菌的培养基1．黄孢原毛平革菌培养基的组成基本培养基：2.Og马铃薯浸出液，20g葡萄糖，3gKH2PO4，1．5gMgSO4·7H2O，0.1mgFeSO4·7H2O，0.2mgCuSO4·5H2O，8mg维生素B1，用蒸馏水定容到1000mL。斜面孢子培养基：采用改良PDA培养基(L-1)：200g马铃薯浸出液，20g葡萄糖，20g琼脂，3gKH2PO4，1.5gMgSO4·7H2O，0.1mgFeSO4·7H2O，0.2mgCuSO4·5H2O，8mg维生素B1。2．培养基的消毒灭菌为了对微生物进行纯培养，防止杂菌污染，必须对微生物生长的培养基进行消毒灭菌。培养基的消毒灭菌步骤如下：将装有液体培养液的锥形瓶塞上棉塞，罩上牛皮纸，用线扎紧。首先在高压灭菌锅内放水，使水面超过加热电阻丝两指左右，放置好锅内桶，在锅内放入待灭菌的培养基和需消毒的物品，盖好锅盖，拧紧螺钉，打开放气阀。然后接上电源，待水烧开3min后(将锅内冷空气赶出后)，关闭放气阀，待压力升高。当温度指到121℃，压力为0．15MPa时，使温度压力恒定。从这时计时25min，关掉电源，等锅内温度冷却下降至0℃刻度，打开放汽阀放气，打开锅盖．再取出培养基及消毒物品。至此，消毒灭菌完毕。所谓“白腐真菌”，并非生物学上的概念。第一，它不属于生物系统分类学范畴的术语，而是从功能角度上对生物进行描述和界定。第二，它既不专指某一种真菌，也不泛指某一些真菌，而是限定为一类腐生在木质上有相同的进攻能力并造成木质发生相同的结构及外观变化——白腐的丝状真菌的总称。白腐真菌是木腐真菌中对木质素降解能力最强的成员，是已知的能在纯培养中将木质素彻底降解为CO2和H2O的唯一的一类生物，因分解术材后留下的残留物为白色而得名。虽然其中的某些种相对于纤维素类成分而言更偏分解木质素，但是它们在腐烂木质过程中几乎是同时破坏多糖和木质素，即能在一定条件下将木质的主要成分(木质素、纤维素、半纤维素)全部降解为CO2和H2O，因在分解过程中木质不被着色，故仍保持白色。黄孢原毛平革菌是白腐真菌的模式菌种，属担子菌纲，典型的木质素降解菌，一般腐生于树木或木材上，使木材上出现袋状、片状或有环痕状等形状的淡色海绵状团块。黄孢原毛平革菌具有发达的菌丝体。菌丝常为多核，一个细胞内随机分布可多达15个核，少有隔膜，无锁状联合。多核的分生孢子常为异核体，担孢子却是同核体。交配系统有同宗配合和异宗配合。在合适的培养条件下，菌丝生长旺盛，且喜欢在空气和水的界面上伸展，容易产生大量的无性分生孢子。分生孢子为具有疏水性且直径5～7μm的卵形颗粒；孢子表面有小杆状结构，带负电荷，等电点接近2．5；表面组成为35％的蛋白质，20％的多糖，33％的类烃物质。分生孢子容易形成及具有数量很大的特点，为苗的种质保存、接种量化和遗传操作提供很大的便利。在整个生活周期中，黄孢原毛平革菌的子实体阶段并不占主要地位，Gold等研究了其子实体形成的生理条件，试验表明：通过对葡萄糖和氮代谢物的抑制，可以控制菌的子实体形成，菌的子实体形成及以后的担孢子的生成。常10～14d内可诱导完成：碳源对子实体形成有很大的影响，其中Walseth纤维素是最佳碳源。氮源的种类和浓度，菌的代谢等对子实体形成产生影响，细胞内环腺苷酸能扭转葡萄糖对子实体形成的抑制作用。研究获得了菌的子实体及担孢子提出了调节模式，从而为菌的杂交提供操作途径。黄孢原毛平革菌的生长分为营养期(初生生长)和繁殖期(次生生长)两个阶段，它们大致对应于细菌系统生长的对数期和禁止期。营养期时，生长是线性的，生物量显著增加；繁殖期时，生长基本停止，甚至发生生物量的下降。因碳、氮营养的限制而触发了次生代谢，进入了木质素降解阶段；两者之间可能会存在一个停滞期。在液体培养条件下，接种后0～24h孢子萌发、菌丝线性生长、营养氮消耗；24～48h线性生长中止、铵透性酶活性的抑制被解除(指示氮危机)；72～96h出现木质素降解活动(合成的14C一木质素一CO2)。总之，黄孢原毛平革菌的生长和代谢活动是复杂的，又是密切与木质素的降解相关的。黄孢原毛平革菌可在木质索细胞腔内产生大量细胞外过氧化物酶，有很强的降解木质素大分子的能力，与对其他难降解的物质一样，木质素实际上是被共代谢的。共代谢有两种方式。一种是通常描述的情况：某种生物能将一种底物转化，却无法在这种底物上生长，即生物体不能利用这种底物的氧化所产生的能量去维持生长；这种现象被称为共氧化、无偿代谢或幸运代谢。二种方式是：一些生物为了共同的效应，共用其生物化学资源，协同作用．对某化合物进行降解。表面上黄孢原毛平革菌属于前一种情况，但因为其对木质素的降解与其本身的初生生长并非同时发生，所以黄孢原毛平革菌对木质素的生物代谢途径和类型是十分复杂多样的。此外．黄孢原毛平革菌的生长及代谢特征，还涉及其他的营养元素的调节，受到培养方式、各种因子和参数等的影响，总之十分复杂。又因木质素是主要植物成分和煤的基本前提物，其结构都是以缩合芳香环为核心结构单元的三维空间的高分子聚合物，主要键型及化学组成都基本相似。事实证明，白腐真菌能氧化分解不少煤的组分，故本实验选用黄孢原毛平革菌来进行煤炭降解转化实验。黄孢原毛平革菌具有特征反应，即反应。最适生长温度为28～39℃，培养温度以28℃或39℃为宜。实验表明，采用孢子接种物可以很快且正常地启动培养反应。孢子接种后，孢子萌发成菌丝，菌丝相互交织成网，1～2d内形成伸展充满整个容器液面的白色薄膜，成为菌丝垫或菌垫。随着培养时间的延长，菌垫与空气接触的表面会形成白色粉状物——孢子。显微镜观察，菌丝的形态与菌的生理状态相关。在培养初期(10d)，菌丝较托，有的呈现螺旋状，无侧分枝，还可以看到厚垣孢子，菌丝在约10d后形态上将经历显著的变化：从老菌丝的细胞壁中直接发育长出新菌丝分枝，菌丝的生长有限且短小，表现出不同于初期的、以菌丝顶端生长为特征的模式。菌丝的这种生长方式及形态特征，与培养体系中木质素降解活性同时发生。在液体振荡培养过程中，孢子接种后，萌发的菌丝在一定的摇速作用下相互缠绕成团，1～3d内形成在容器里随机碰撞的白色小球，称为菌丝团或菌团，孢子接种物形成菌团被认为是一种自然发生的自固定化过程。在浸没培养中，菌团的大小及数量随接种量和转速而变化：接种基大，菌团越大；转速越大，菌团越小，数目越多。在100～200r／min下，菌团直径为3～5mm。后来的实验研究表明，在相同的实验条件下，经过诱变后的菌在振荡培养时，菌团的直径变小，有的还会发生变色反应，其机理有待以后进一步研究。黄孢原毛平革菌对振荡所产生的机械剪切力高度敏感，产生这种情况的生理基础是：菌在对木质素及其他异生物质的降解中主要起作用的“工作酶”为胞外酶，菌又是好氧微生物，氧是影响反应及降解效率的重要因子；为提高氧的运输及传质效果所采用的振荡，会严重破坏酶的结构和活性。黄孢原毛平革菌的固体培养主要是平板培养，研究实验是以扩大菌的生物量或大量获得孢子为目的的繁殖培养或扩增性培养。在繁殖培养的平板体系中，无论是孢子接种还是菌丝体接种，菌在平板上呈扩散状生民，数天内整个平板表面布满了白色的菌丝。菌丝向培养基内伸人，在离表面约1mm厚的琼脂区内形成坚固的菌丝层。随着培养时间的延长，菌丝向气相伸展，产生大量的孢子，形成的白色粉状物遍布全平板。如果是进行检测培养，则在接种区周缘先形成反应区带，区带的宽度随反应时间而增大；理想条件下会导致整个平板发生反应。这种现象在以染料为处理对象的平板中最为明显，染料脱色或变色区带的宽度及反应程度，直观地指示了菌的降解能力。煤炭生物降解转化实验的平板转化实验，即是利用平板培养过程中发生的变色反应来进行的；在煤炭生物降解转化过程中采用固体形式，其意义更多的偏向于定性实验研究。总之，平板体系具有反应迅速、操作简单、测定方便等优点，在以定性为主要目的的初试性研究中具有一定意义和优势。根据球红假单胞菌微生物生长量的测定方法，选用干重测定法对黄孢原毛平革菌进行生长量的测定。其方法为：用60℃干燥箱烘干至恒重后，用称重的滤纸来过滤培养液。由于黄孢原毛平革菌菌丝附着在锥形瓶壁上，用蒸馏水洗涤干净并过滤；用蒸馏水洗涤过滤物除去培养基成分后，转移到培养皿中，另取一干净滤纸密封培养皿，置60℃干燥箱烘干6h后，称重。从培养过程中可以发现，24h之前黄孢原毛平革菌培养液中菌丝体很少，30h之后菌丝体快速生长，42h之后菌体生长速度开始趋于缓和，这可能是由于培养液中营养物质消耗殆尽，并且菌体进入了生长期后期造成的。另外，还可以观察到在液体培养基中菌体的生长速度比在固体培养基中的快，且随着培养时间的延长，菌体聚集成块，最后浮于培养液的表面。分析可知，黄孢原毛平革菌的生长期在30h～42h之间。黄孢原毛平革菌培育生长曲线如图3—1所示。1．群体形态特征黄孢原毛平革菌的形态特征描述如下：(1)固体培养菌种接种后，在平板上呈扩散状生长，数天内整个平板表面布满了，白色的菌丝。菌丝向培养基内伸人，在离表层约1mm厚的琼脂区内形成坚固的菌丝层。随着培养时间的延长，菌丝向气相伸展，产生大量的孢子，形成的白色丝状物遍布全平板，如图3—2所示。(2)液体培养①静置培养：纯化培养时，接种之后萌发出菌丝，菌丝相互交织成网，1～2d内形成伸展充满整个容器液面的白色薄膜，成为菌丝垫或菌垫。在液体培养(250mL三角瓶中50mI，液体培养基)中，厚度约为1．0～1．5mm的菌垫位于气液交界面，便于获得氧。随着培养时间的延长，菌垫与空气接触的表面会形成白色粉状物——孢子。若培养时间(10d)更长一些，菌垫表面会形成绿色粉状物——孢子。②振荡培养：菌种接种后，萌发的菌丝在一定的摇速作用下相互缠绕成团，1～3d形成在容器里随机碰撞的白色小球，成为菌丝团或菌团，如图3—3所示。2．个体形态特征主要是形态观察，进行芽孢染色。芽孢染色方法如微生物的形态研究中所述事孢染色如图3-4所示。显微镜观察菌丝，菌丝的形态与菌种的生理状态相关。在培养的初期(10d)菌丝较长，有的呈螺旋状，无侧分枝，如图3-5所示。3．生理生化反应黄孢原毛平革菌的特征反应如微生物的形态研究中所述。试验中，在培养皿中接种白色绒状菌落，用加入琼脂及少量单宁酸的专项培养基，温度控制在30℃。经过3d培养后，在菌落外侧形成了肉眼可见的褐色轮环，如图3-6所示。