黄芩中黄芩苷的正交提取工艺及抑菌活性研究

1黄芩中黄芩苷的正交提取工艺及体外抑菌活性研究杨明1，陶蕾2,4，王文3，赵强4，陈虹4(1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉744000；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州730050；3.甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州730070；4.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070)摘要：采用正交提取法提取黄芩中黄芩苷，将提取物进行HPLC检测，并对两种供试菌进行体外最小抑制浓度（MIC）测定。结果表明：最佳正交提取工艺为A2B2C3，即乙醇浓度70%、乙醇体积100mL、冷浸时间36h；对大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC分别为：0.50mg/mL和0.20mg/mL。关键词：黄芩苷；正交提取；体外抑菌TheOptimizationofExtractionProcessbyOrthogonalTestandInvitroAntibacterialActivityforBaicalinYangMing,Taolei,WangWen,ZhaoQiang,ChenHong（1.GansuInstituteofAnimalandVeterinarySciences,PingliangGansu,744000；2.LanzhouInstituteofAnimalandVeterinaryPharmceuticalSciences,ChineseAcademayofAgricultralSciences,LanzhouGansu,730050；3.PrataculturalCollegeofGansuAgricaltureUnivesity,LanzhouGansu,730070；4.CollegeofVetetinaryMedicineatGansuAgricaltureUnivesity,LanzhouGansu,730070）Abstract:TooptimizetheextractconditionsbyorthogonaltestforbaicalinofScutellariabaicalensi.thecontentsofbaicalinweredeterminedbyHPLCandminimalinhibitoryconcentration(MIC)weremeasuredbymeansofbacteriostasistestsinvitroontwokindsofbacteriatothebaicalin.TheresultsshowedthatTheoptimumextractingconditionswereA2B2C3,thatwasthecold-maceration,70%alcohol100mLasthesolventsandtoextractfor36h;MICofthebaicalinagainstEscherichiacoliandStaphylococcusaureuswas0.50and0.20mg/mLrespectively.Keywords:baicalin;extractionprocessbyorthogonaltest;invitroantibacterialactivity黄芩为唇行科植物，味苦、性寒。具有清热燥湿，泻火解毒，止血、安胎的功效[1、6]。主治湿温、暑温胸闷呕恶、湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、高温烦热、胎动不安等症。黄芩是祖国医学中常用中药，来源丰富、价廉。黄芩苷是黄芩的主要有效成份，本实验主要通过正交试验，探究出黄芩中黄芩苷提取量的影响因素，优化实验设计，并将提取出的黄芩苷对供实菌进行抑菌实验，以为相关疾病的防治提供理论依据。1材料与方法基金项目：甘肃省技术研究与开发专项计划项目（QS031-C31-11）作者介绍：杨明（1979-），男，汉族，甘肃山丹人，助理研究员，硕士。研究方向：畜禽传染病诊断、防治与药物开发，天然药物提取分析技术等的研究。21.1材料1.1.1药材黄芩粉末（购买于甘肃省平凉市药材站，经自然风干，粉碎）。1.1.2仪器设备及药品RE52-99旋转蒸发器、ZDP-2120型电热培养箱、UV-9200型紫外-可见光分光光度计、电子分析天平。95%乙醇、甲醇、黄芩苷标准品、乙腈、甲酸、三重蒸馏水等，其余试剂均为国产或进口分析纯。1.1.4培养基及菌种牛肉膏蛋白胨培养基，按规定方法配制，分装灭菌备用。大肠埃希氏杆菌（Escherichiacoli，ATCC35216）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，ATCC26111）为甘肃省畜牧兽医研究所实验室保存标准菌株。1.2方法1.2.1样品的制备精密称取黄芩粗粉10g，按表1的L9(33)正交试验提取条件冷浸提取，减压旋转蒸发至干，然后把提取的黄芩苷溶解在70%甲醇中进行HPLC分析。1.2.2色谱条件色谱柱：CloversilC18柱(4.6mm×150mm，5μm)，检测波长240-280nm，柱温30℃，进样量5μL，流速0.6mL/min，流动相V(乙腈)∶V(甲酸)=99.5∶0.5。1.2.3抑菌实验把实验所用菌株接种于平皿培养基37℃培养过夜，挑选典型菌落接种于液体培养基中，经37℃培养24h，将从黄芩中提取的黄芩苷进行倍比稀释，制备系列浓度稀释液。然后用无菌吸管将稀释液分别定量加入到无菌培养皿中，与定量倒入的培养基充分混匀，制成含药液平板。再按培养皿上标的计量，用移液管分别吸取定量被试菌液，涂于平板上，培养一段时间后，以观测完全没有菌落生长的最低黄芩苷浓度作为该药物的最小抑菌浓度（MIC），以未加药品之平皿为空白对照[2、3]。2结果与分析2.1黄芩中黄芩苷的正交提取工艺结果与分析根据预试实验，对影响黄芩苷提取量的主要因素：乙醇浓度、乙醇用量、冷浸时间，按照L9(33)正交表进行正交实验，其结果见表1-3所示。3表1黄芩中黄芩苷正交实验因素水平表Table1theextractfactorsandlevelsintheorthogonaldesignsforbaicalinofScutellariabaicalensi水平因素A乙醇浓度/%B乙醇体积/mLC冷浸时间/h15050122701002439015036表2正交实验设计表及结果Table2theorthogonaldesigntableandresults实验号ABC产品质量/gOD510纯度/%15050120.28900.15379.6250100240.26670.14776.9350150360.28430.15982.547050240.37340.18380.8570100360.40720.19785.7670150120.38300.19283.779050360.31590.16782.0890100120.32330.17178.6990150240.31290.16983.9K10.28000.32610.3317K20.38790.33240.3176K30.31730.32670.3358R0.10460.00630.0182表3方差分析结果Table3theresultsofanalysisofvariance误差来源离差平方和自由度均方F显著性水平A0.017820.008944.5**B0.000420.0002C0.000420.0002误0.000520.0003总0.019180.0024由表2可知，I1AI3AI2A、I1BI3BI2B、I2CI1CI3C。因此，A、B、C三个因素中最佳水平是A2、B2、C3，主次因素依次为:ACB。选择最佳提取工艺为A2B2C3，即乙醇浓度70%、乙醇体积100mL、冷浸时间36h。由表3可知，因素A对提工艺有极显著性影响(P0.01)，因素B、C对提取工艺没有统计学意义。2.2黄芩中黄芩苷的HPLC检测结果与分析4黄芩中黄芩苷的HPLC检测结果见图1所示。在本实验条件下，黄芩中的主要成分都能得到很好的分离，结合标准品，对照保留时间和紫外吸收可以确定黄芩苷是其主要成分。图1黄芩提取物的HPLC图Fig.1HPLCchromatogramsofScutellariabaicalensiextract2.3黄芩中黄芩苷的的抑菌测定结果与分析将从黄芩中提取出来的的黄芩苷溶解后稀释成0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL、0.70mg/mL7组浓度系列，另设对照组，然后测定MIC（见表4所示）。表4黄芩中黄芩苷MIC的测定结果Table4theMICresultsofthebaicalinagainstEscherichiacoliandStaphylococcusaureus供试菌n不同浓度黄芩苷（mg/mL）溶液的MIC0.100.200.300.400.500.600.70对照组金黄色葡萄球菌3+——————+++大肠埃希氏杆菌3++++++++———+++注：表中数据为3次试验的重复值，+表示生长菌，++表示细菌生长较茂盛，+++表示细菌生长茂盛，—表示无细菌生长。从表4可以看出，黄芩中黄芩苷对大肠埃希氏杆菌的MIC为0.50mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC为0.20mg/mL，对两种供试菌的抑制作用显著[4，5]。3结论本实验初步建立了黄芩中黄芩苷的正交化学提取工艺模式。提取物经HPLC法检测，其数据与文献报道基本一致，故可认定提取物主要成分为黄芩苷[6、7]。使用所提取的黄芩苷对两种典型供试菌进行体外抑菌试验，其抑制作用显著，尤其对金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强。通过本实验研究，以期探求黄芩的生物活性，为中药黄芩的物质基础研究及药理学研究提供一定的试验参考。5参考文献：[1]任玲玲,张春枝,陈吉平,等.黄芩的抗菌活性及HPLC分析[J],精细化工.2005,8(22):589-591.[2]董晓宁,赵强,杨明.苦荞麦中芦丁提取及体外抑菌活性研究[J],中兽医医药杂志.2010,1.21-23。[3]赵强,杨明,王志强.高效液相色谱法测定鹅肉中磺胺类药物的残留[J],国外畜牧学—猪与禽.2010,6:71-72.[4]熊英,傅颖媛,况南珍,等.黄芩苷抗白念珠菌作用及机制研究[J],中国药理学通报.2004,20(12):1404-1407.[5]张涛,黄会岭,张爽,等.盐酸小檗碱、绿原酸和黄芩苷在兔体液内浓度与其体外抑菌浓度的差异研究[J],中国农业科学.2008,41(12):4225-4229.[6]翟保同,王莹.黄芩苷提取工艺研究[J],中国医药导报.2007,8(23):90-93.[7]孙艳平,董秀华.黄芩苷体外诱导肺炎支原体耐药的实验研究[J],期中医药信息.2010.4(27):115-117.邮箱：[e-mail]联系电话：[phone]