黄芩苷酶的制备及其理化性质研究

黄芩苷酶的制备及其理化性质研究任慧霞张敏山东大学药学院生化与生物技术药物研究所（济南250012）摘要：目的研究黄芩苷酶的制备及其理化性质。方法采用提取、透析、sephadexG150凝胶柱层析及冷冻干燥的方法获得黄芩苷酶；利用Linewear-Burk作图法求得该酶对黄芩苷的Km值，研究了pH值、温度、离子强度、底物浓度等对黄芩苷酶活力的影响。结果该酶对黄芩苷的Km值为57.4mmol/L，最适pH值为5.8，温度为45℃，不同离子的影响、分子量，底物浓度及产物对该酶活性基本无影响，反应初速度随酶浓度的增加而增加并呈现良好的线性关系。结论获得活性较高理化性质较稳定的一种黄芩苷酶。关键词：黄芩苷；糖苷酶；理化性质关于PreparationandCharacterizationaboutflavonoidsGlycosidaseRENHui-xiaZHANGMin,InstitueofBiochemicalandBiotechnologicalDrug,SchoolofPharmaceuticalScience,ShandongUniversity,Jinan250012Abstract：PurposeTomeasuretheKmofthisflavonoidsGlycosidasefromScutellariabaicalensisGeorgiwithbaicalin，studytheeffectofpH,temperature,ionicstrengthandsubstrateconcentrationonenzymeactivity,andthelinearrelationofenzymeconcentration.MethodsUsingmeansofcollectionanddislysis,sephadexG150columnchromatographytopreparecrudeenzyme.MeasuringKmbyLinewear-Burkgraphicmethod,calculatetheenzymeactivitybymeasuringtheabsorbanceofbaicaleinat450nmwithultravioletspectrophotometry.ResultsTheKmwithbaicaleinis57.4mmol/L,itsoptimumpH,temperature,ionicstrengthandsubstrateconcentrationis5.8,45℃,1mol/L，40mmol/L，respectively.ConclusionThephysico-chemicalpropertyofthisnewflavonoidsGlycosidasefromScutellariabaicalensisGeorgiwasstudied.Keywords:Glycosidase;Characterization；糖苷酶是指一类以内切或外切方式水解各种含糖化合物(包括单糖苷、寡糖、多糖、皂甙、糖蛋白等)中的糖苷键,生成单糖、寡糖或糖复合物的酶，它是维持生物体基本功能的重要酶类之一,在自然界广有分布,几乎各种类型的动、植物和微生物中,都有糖苷酶存在[1，2]。常根据其降解的底物对其命名，,如水解β-D-葡萄糖苷键的酶称为β-D-葡萄糖苷酶，水解甘露糖苷键的酶称为甘露糖苷酶。本实验室研究的主要是能将黄芩中黄芩苷降解为黄芩素的一类糖苷酶，故称之为黄芩黄苷酶。黄芩为唇形科植物黄芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）的干燥根。在临床中属常用中药，用于治疗上呼吸道感染、泌尿系统感染、菌痢、肝炎、高血压等[3]。黄芩苷(baicalin)是黄芩中主要的有效成分之一,属葡萄糖醛酸苷类,水解后产生黄芩素和葡萄糖醛酸,具有清热解毒、抗炎、利胆、降压、利尿、抗变态反应等多方面的作用[4]。本文主要对其理化性质进行了初步的研究，测定了其动力学常数Km值，考查了pH值、温度、离子强度、底物浓度对酶活力的影响，以及酶浓度的线性关系。1材料与方法1.1材料酶提取植物原料，实验室购得；黄芩苷标准品，实验室自制；黄芩素标准品，实验室自制；透析袋，；sephadexG150，SIGMA公司；其他试剂均为国产分析纯。AKTAexplorer快速蛋白质纯化系统,AmershamBiosciences公司；UV-2102PC型紫外可见分光光度计，Unico上海仪器有限公司；冷冻离心机，Heraeus公司；FD-1-55冷冻干燥机，北京博医康试验仪器有限公司。方法1.2.1粗酶的分离纯化1.2.1.1原料的预处理：称取原料植物干燥粉末25g，加入十倍体积的蒸馏水溶解置于45℃烘箱内过夜后，抽滤，弃残渣保留上清液，备用。1.2.1.2透析除去小分子：取上述上清液加入透析袋内，用蒸馏水磁力搅拌透析，直至外液无色为止。1.2.1.3sephadexG150柱色谱：上述透析产物在室温条件下使用AKTA分离层析系统上sephadexG150柱色谱，洗脱液是经过滤和脱气的蒸馏水，流速为1.0mL/min。分部收集，检测酶活力并收集有酶活力的洗脱液。1.2.2酶活力单位IU定义测定条件下(pH值为5.8，45℃)每小时催化水解黄芩苷生成1μmol产物黄芩素所需的酶量为1个酶活力单位（IU）。1.2.3粗酶活性测定：在空白和试验管中各加入一定量的标准黄芩苷溶液，在45℃下水浴，再在试验管中加入相同体积的粗酶液，混匀，同时空白管中加入等体积的蒸馏水，45℃下精确反应一定时间后，取出冷却至室温，后8000r/min离心20min,倒出上清夜，保留沉淀，试验管沉淀用等量的甲醇溶解，空白管倒出上清夜后加入甲醇溶液做为对照，采用分光光度法在450nm处测定其吸光度。1.2.4黄芩素标准曲线制作：配置一定浓度的黄芩素标准溶液（溶剂为甲醇），然后用甲醇（分析纯）依次稀释至不同浓度，再以甲醇为空白，在450nm处测定各个浓度黄芩素溶液的吸光度，黄芩素溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做出标准曲线。1.2.5动力学常数（Km）的测定：粗酶液与不同浓度的黄芩苷反应，利用反应中止法测定酶反应的初速度（V），再根据Linewear-Burk[5]作图法求得该粗酶对黄芩苷的Km值。1.2.6理化性质1.2.6.1pH值对酶活力的影响在不同的pH值（4.0，5.0，5.8，7.0，8.77，10.08）的缓冲液中，其他条件不变，测定酶活力。1.2.6.2温度对酶活力的影响在不同温度（4，25，35、40、45，50和60、70、80℃）下水浴恒温24h后，按常规方法测酶活。1.2.6.3离子强度对酶活力影响在酶反应液中分别加入不同浓度(0，0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0mol／L)的Nacl溶液，其他条件不变，测定酶的活力。1.2.6.4底物浓度对酶活的影响将不同浓度（0，1.60，3.20，4.80，8.01，12.81，16.02，24.02，32.03，40.04，48.05mmol/L）的底物与相同量的粗酶液反应，测定酶活，观察与底物浓度的关系。1.2.6.5不同酶浓度的线性关系考察取分离得到的粗酶样品液梯度稀释，测定酶活性。2结果2.1sephadexG150柱色谱结果经sephadexG150柱色谱可将透析产物分成3个组分，并测得第一个组分有活性(图1)。2.2黄芩素标准曲线用不同浓度的黄芩素标准溶液绘制浓度和吸光度的黄芩素的标准曲线（图2）。y=0.176xR2=0.998400.10.20.30.40.500.511.522.53浓度（mol/L）吸光度（Abs）2.3Km值用Linewear-Burk作图法求出该酶对黄芩苷的Km值为57.4mmol/L（图3）。-0.08-0.06-0.04-0.0200.020.040.060.080.1-0.4-0.200.20.40.60.811.21/[S]1/V图3黄芩黄酮糖苷酶的Linewear-Burk图2.4理化性质2.4.1pH值对酶活力的影响该酶在pH5.0-7.0的范围内活性较高，最适pH值为5.8（图4）。-0.500.000.501.001.502.002.503.003.50024681012pH值酶活力（IU）图4pH值对酶活力的影响2.4.2温度对酶活力的影响该酶对温度较敏感，当温度升高到45℃后，酶活力开始下降，80℃时已经失活，最适温度为45℃（图5）。0.000.501.001.502.002.50020406080100T/℃酶活力（IU)图5温度对酶活力的影响2.4.3离子强度对酶活力影响在酶反应液中分别加入不同浓度氯化钠(0～4mol/L)的氯化钠溶液，随着离子强度的升高，酶活力逐渐增大，但是当离子强度升高到1mol/L后，酶活力开始下降，因此最适氯化钠浓度为1mol/L（图6）。0.000.200.400.600.801.001.20012345氯化钠浓度（mol/L）酶活力（IU）图6离子强度对酶活力的影响2.4.4底物浓度对酶活的影响随着底物浓度的升高，酶活力逐渐增大，且与底物浓度成正比，当底物浓度达到40mmol/L时，酶活力达到最大，底物浓度继续增大，酶活力基本保持不变（图7）。0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.800102030405060底物浓度（mmol/L）酶活力（IU）图7底物浓度对酶活力的影响2.4.5不同酶浓度的线性关系考察酶浓度对反应速度呈良好的线性关系（图8）。y=0.5722xR2=0.997100.10.20.30.40.50.60.70.80.9100.20.40.60.811.21.41.6酶浓度吸光度（Ab）图8不同酶浓度的线性关系3讨论由于此种黄芩糖苷酶是本实验室从植物中提取的一种糖苷酶，通过溶解过滤后得到的原料液，以透析的方法，大量透去小分子物质，后经sephedexG150凝胶过滤后得到单一组分的粗酶，利用这一粗酶进行理化性质的研究。由于此种糖苷酶与黄芩苷作用，将其降解得到黄芩素，不容易水，而易溶于甲醇，可用分光光度法在450nm处测定，方法简单、反应活性大，所以本实验采用黄芩苷作为底物的分光光度法测定该酶活性。考查了pH值、温度、离子强度、底物浓度对酶活力的影响，以及酶浓度的线性关系。pH值和温度的影响图形都呈倒钟型分布，对酶活力的影响较大，最适Nacl离子强度和底物浓度分布为1mol/L和40mmol/L。理化性质的研究，为其今后深入的性质和应用研究奠定了基础，同时也提供了有力的依据和参考。参考文献[1]JacobsonR,SchleinY,EisenbergerC.ThebiologicalfunctionofsandflyandLeishmaniaglycosidases[J].MedicalMicrobiologyandImmunology,2001,190：51-55.[2]冯世江,李春,曹竹安.糖苷酶及其在糖基化合物改性中的研究[J].生物加工过程，2006，4（3）：16-20.[3]宋立人,洪恂,丁绪亮,等.现代中药学大辞典[M].北京：人民卫生出版社,2001:1865-1869.[4]张喜平田华程琪辉.黄芩苷的药理作用研究现状[J].中国药理学通报,2003,(11):1212-1215.[5]胡晓燕，张孟业.生物化学与分子生物学实验技术[M].济南：山东大学出版社，2005：89-91.