黄酮化合物芦丁的提取分离和鉴定

1河南理工大学天然产物的分离与纯化实验专业班级学号姓名准备教师斯琴格日乐指导教师斯琴格日乐时间2010-2011年第2学期2目录讲义内容：实验一小檗碱的提取、精制、鉴定及含量测定--4学时实验二黄酮化合物芦丁的提取、分离和鉴定----4学时实验三阿魏酸的提取、分离和鉴定-----------4学时报告内容：预习报告实验报告3实验二黄酮化合物芦丁的提取、分离和鉴定一、目的要求1、通过芦丁的提取与精制掌握超声波法提取黄酮类化合物的原理及操作。2、掌握高效液相法分析黄酮类化合物二、重点难点3、芦丁的提取方法：超声波法提取黄酮类化合物的原理及操作。4、掌握HPLC法三、学时4学时四、实验原理高效液相色谱法（HPLC）是在20世纪60年代末期，在经典液相色谱法的基础上发展起来的新型分离方法。高效液相色谱法中反相色谱在测定黄酮含量中扮演着中心角色，它是基于溶质在极性流动相和非极性固定相表面之间的疏水效应建立的一种色谱模式。应用反相HPLC分析黄酮类化合物，一般优先选甲醇-水体系为流动相。为了提高分离度，常常需要梯度洗脱。由于黄酮类化合物常带有酚羟基，在水中会部分解离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从而导致拖尾。所以黄酮类化合物的反相HPLC中需加入酸如乙酸调节PH，抑制解离，克服拖尾现象。本研究以芦丁为对照品，通过高效液相来测定怀菊花的黄酮含量。五、仪器与试剂怀菊花，HPLC，超声提取器，医用离心机，真空泵，芦丁标准品，甲醇为色谱纯，乙醇为分析纯等。.六、方法色谱柱:C18柱(4.6mmX50mm,5µm,)；流动相:甲醇-0.2%冰乙酸(25:75)；流速:0.50mL·min-1;检测波长:260nm；柱温:250C;进样量为L10；在此条件下测得黄酮含量的色谱图。七、实验内容1.对照品溶液的配制分别精密称取芦丁对照品10mg，用30%乙醇溶解，置100ml棕色容量瓶里，加30%乙醇配制成浓度为0.1mg·mL-1的对照品溶液；然后从0.1mg·mL-1的对照品溶液分别取2mL，4mL，6mL，8mL，10mL置50mL棕色容量瓶中，加30%乙醇配制成4ug·mL-1，8ug·mL-1，12ug·mL-1，16ug·mL-1，20ug·mL-1的标准溶液，备用。2．样品溶液的制备原料的预处理:选取市售怀菊花若干，洗净，晾干，之后放入电热鼓风干燥箱60℃的条件下烘干，烘干之后，然后用搅碎机搅成粉末，研磨，过筛，备用。准确称取怀菊花0.2g，放在具塞锥形瓶中,加4mL浓度为70%的乙醇，密塞，超声提取1h，放冷，在离心机离心30min，将上清液在真空抽滤机下过滤，再用0.45μm微孔滤膜滤过，取过滤液,定容至50ml容量瓶，备用。3.空白试验取对照品溶液、供试品溶液及空白对照溶液各10µl,依法测定,结果表明,空白样品中有无干扰。4.线性关系的考察以上述4ug·mL-1，8ug·mL-1，，12ug·mL-1，，16ug·mL-1，，20ug·mL-1，的标准溶液为横坐标（X），以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得方程为y=33.29x-8.284，r=0.9993，结果表明线性关系良好。浓度ug·mL-1，48121620峰面积1192543865256625、精密度试验以上述4ug·mL-1，，8ug·mL-1，，12ug·mL-1，，16ug·mL-1，，20ug·mL-1，的标准溶液，按上述色谱条件测定，每次进样10uL，重复进样6次，结果封面积的RSD小于5%，说明精密度良好。6、稳定性试验精密量取供试品溶液10uL，分别在1h，2h，3h，4h，6h，8h，10h，12h，24h进样，测定峰面积，在24h内其RSD小于5%，说明样品的稳定性好。7、重复性试验4取怀菊花样品，精密称取5份，每份0.2g,按上述方法制备样品溶液，按上述色谱条件测定含量，计算芦丁含量平均值，结果表明可以重复试验。8.加标回收率试验量取已知含量的样品1mL，然后加4ug·mL-1的芦丁标准溶液2mL，摇匀，按上述色谱条件进样10uL，测定峰面积，计算平均回收率。9.样品测定取怀菊花0.2g,按2法制备成样品溶液,分别取对照品溶液和样品溶液各10µl进样,在上述色谱条件下测定,按外标法计算芦丁的含量。结果见表。测定提取出的样品结果编号峰面积浓度（ug/ml）芦丁含量（mg/g）1号195.46.1215.32号202.06.3215.85天然产物的分离与纯化实验预习报告实验项目：黄酮化合物芦丁的提取、分离和鉴定一、实验目的：1、通过芦丁的提取与精制掌握超声波法提取黄酮类化合物的原理及操作。2、掌握高效液相法分析黄酮类化合物二、实验原理：高效液相色谱法（HPLC）是在20世纪60年代末期，在经典液相色谱法的基础上发展起来的新型分离方法。高效液相色谱法中反相色谱在测定黄酮含量中扮演着中心角色，它是基于溶质在极性流动相和非极性固定相表面之间的疏水效应建立的一种色谱模式。应用反相HPLC分析黄酮类化合物，一般优先选甲醇-水体系为流动相。为了提高分离度，常常需要梯度洗脱。由于黄酮类化合物常带有酚羟基，在水中会部分解离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从而导致拖尾。所以黄酮类化合物的反相HPLC中需加入酸如乙酸调节PH，抑制解离，克服拖尾现象。本研究以芦丁为对照品，通过高效液相来测定怀菊花的黄酮含量。三、实验内容及步骤：1.对照品溶液的配制分别精密称取芦丁对照品10mg，用30%乙醇溶解，置100ml棕色容量瓶里，加30%乙醇配制成浓度为0.1mg·mL-1的对照品溶液；然后从0.1mg·mL-1的对照品溶液分别取2mL，4mL，6mL，8mL，10mL置50mL棕色容量瓶中，加30%乙醇配制成4ug·mL-1，8ug·mL-1，12ug·mL-1，16ug·mL-1，20ug·mL-1的标准溶液，备用。2．样品溶液的制备原料的预处理:选取市售怀菊花若干，洗净，晾干，之后放入电热鼓风干燥箱60℃的条件下烘干，烘干之后，然后用搅碎机搅成粉末，研磨，过筛，备用。准确称取怀菊花0.2g，放在具塞锥形瓶中,加4mL浓度为70%的乙醇，密塞，超声提取1h，放冷，在离心机离心30min，将上清液在真空抽滤机下过滤，再用0.45μm微孔滤膜滤过，取过滤液,定容至50ml容量瓶，备用。3.空白试验取对照品溶液、供试品溶液及空白对照溶液各10µl,依法测定。4.线性关系的考察以上述4ug·mL-1，8ug·mL-1，，12ug·mL-1，，16ug·mL-1，，20ug·mL-1，的标准溶液为横坐标（X），以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。5.精密度试验以上述4ug·mL-1，，8ug·mL-1，，12ug·mL-1，，16ug·mL-1，，20ug·mL-1，的标准溶液，按上述色谱条件测定，每次进样10uL，重复进样6次。6.稳定性试验精密量取供试品溶液10uL，分别在1h，2h，3h，4h，6h，8h，10h，12h，24h进样，测定峰面积。67.重复性试验取怀菊花样品，精密称取5份，每份0.2g,按上述方法制备样品溶液，按上述色谱条件测定含量。8.加标回收率试验量取已知含量的样品1mL，然后加4ug·mL-1的芦丁标准溶液2mL，摇匀，按上述色谱条件进样10uL，测定峰面积，计算平均回收率。9.样品测定取怀菊花0.2g,按2法制备成样品溶液,分别取对照品溶液和样品溶液各10µl进样,在上述色谱条件下测定,按外标法计算芦丁的含量。四、预习中发现的问题及解决方法：1、标准样品放置久了，会变质吗？答：会的，因为芦丁是一种生物活性物质。2、流动相里为什么要加少量冰乙酸，加到PH值为多少合适？答：为了提高分离度，常常需要梯度洗脱。由于黄酮类化合物常带有酚羟基，在水中会部分解离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从而导致拖尾。所以黄酮类化合物的反相HPLC中需加入酸如乙酸调节PH，抑制解离，克服拖尾现象。五、实验过程原始记录：芦丁标准样品的峰面积浓度ug·mL-148121620峰面积119254386525662测定提取出的样品结果指导教师签字：年月日编号峰面积浓度（ug/ml）芦丁含量（mg/g）1号195.46.1215.32号202.06.3215.87天然产物的分离与纯化实验预习报告实验项目：一、实验目的：二、实验原理：三、实验内容及步骤：8四、预习中发现的问题及解决方法：五、实验过程原始记录：指导教师签字：年月日9天然产物的分离与纯化实验实验报告专业班级姓名学号同组人实验时间年月日实验成绩课程名称：天然产物化学实验项目：黄酮化合物芦丁的提取、分离和鉴定一、实验目的：如上二、实验原理：如上10三、实验内容及步骤：如上四，、讨论：超声波提取技术用于类黄酮提取时具有提取时间短，提取率高、低温提取、成本低、污染少、容易实现产业化等优点。本实验采用芦丁对照品作对照，用甲醇-0.2%乙酸水溶剂系统进行梯度洗脱，使其得到了较好的分离，用高效液相操作简单、快速、分离效果好；同时对照品的图谱与样品能达到高度一致，有类似指纹图谱的功效，故可用于怀菊花的定性定量检测。用高效液相法测怀菊花中芦丁含量，该方法重现性和精密度良好，可用于中药材的检测与质量控制，为其他黄酮化合物的鉴定提供新的参考。指导教师签字：年月日11天然产物的分离与纯化实验实验报告专业班级姓名学号同组人实验时间年月日实验成绩课程名称：实验项目：一、实验目的：二、实验原理：12三、实验内容及步骤：四、讨论：指导教师签字：年月日13