黑曲霉利用五倍子固体发酵产单宁酶的条件研究

黑曲霉B0201利用五倍子固体发酵产单宁酶的条件研究摘要:通过比较常规灭菌发酵和生料发酵,研究黑曲霉B0201利用五倍子固体发酵产单宁酶的条件。结果表明,在生料发酵过程中,采用20%五倍子并且以(NH4)2SO4为氮源制备单宁酶的最佳条件为:液固比=1.6:1、温度30°C、初始pH6.0。在该条件下通过96h的培养,单宁酶的活力可达51.2U/gds,是常规灭菌发酵的3.6倍。以上结果显示,生料发酵生产单宁酶是一种高效可行的方法。关键词:黑曲霉,单宁酶,生料发酵,五倍子,固体发酵ResearchonConditionsofTannaseProductionfromAspergillusNigerB0201UnderSolid-stateFermentationUsingGallnutLIYang-Zhen1,2QIUShu-Yi1,2*BAOYu-Xin1,3WuXin-Ying1,2(1.GuizhouProvinceKeyLaboratoryofFermentationEngineeringandBiopharmacy,Guiyang,Guizhou550003,China)(2.ChemicalEngineeringCollegeofGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550003,China)(3.LifeScienceCollegeofGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550000,China)Abstract:Accordingtothecomparativeresearchofconventionalsterilefermentationanduncookedmaterialfermentation,theconditionsoftannaseproductionfromAspergillusNigerB0201undersolid-statefermenta-tionusinggallnutwasstudied.Theresultsshowedthattheliquid−solidratioof1.6:1,temperatureof30°C,initialpHof6.0weretheoptimalconditionsfortannaseproductionunderuncookedmaterialfermentationwithgallnutcontentof20%and(NH4)2SO4fornitrogensources.Underthiscondition,tannaseactivityreachedto51.2U/gdsafter96hofcultivation,whichwas3.6timesastheconventionalsterilefermentation.Theresultsaboverevealedthatunderuncookedmaterialfermentationfortannaseproductionwasafeasiblemethodwithhighefficiency.Keywords:Aspergillusniger,Tannase,Uncookedmaterialfermentation,Gallnut,Solid-statefermentation1124微生物学通报2009,Vol.36,No.8单宁酶,可水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键,生成没食子酸和葡萄糖[1]。单宁酶可应用于制革、酿酒、医药、饮料等领域,具有广阔的应用前景。但是目前生产单宁酶的效率不高,市场价格昂贵,阻碍了单宁酶的应用。单宁酶是一种诱导酶,主要利用微生物发酵生产。目前国内主要采用液体发酵法生产单宁酶[2,3],而国外近期的研究主要集中在固体发酵法[4−6]。很多资料[7−9]显示固体发酵主要产胞外单宁酶,容易提取,稳定性好,杂酶少,且设备比较简单,同时固体发酵有利于提高产酶活力。本实验室筛选出的黑曲霉B0201菌株能利用中国特产五倍子作为诱导物固体发酵产单宁酶。但是在试验过程中发现原料五倍子在高压蒸汽灭菌时很容易焦化,变成褐色,粘稠。高温破坏了五倍子的结构,对黑曲霉菌株生长产生危害,严重影响单宁酶的产量。尤其当培养基中五倍中含量较大时,高温对培养基的破坏更明显,黑曲霉菌株完全不能生长。为解决这个问题,本文采用生料固体发酵的方法生产单宁酶。有资料[10]显示五倍子具有抗菌消炎作用,五倍子粉、五倍子浸液等体外实验时对金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌以及伤寒、副伤寒、痢疾、炭疽、白喉、绿脓杆菌等均有明显的抑菌或杀菌作用,而且固体发酵过程中固态培养基水活度低,能降低染菌概率[11],所以生料固体发酵在理论上是可行的。本文比较了常规灭菌发酵和生料发酵对黑曲霉利用五倍子固体发酵产单宁酶的影响,对发酵过程中的参数进行了比较研究,发现了生料发酵的优势,并优化了生料发酵的产酶条件,得到一种高效可行的产单宁酶的方法。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种:黑曲霉B0201(Aspergillusniger),由贵州省发酵工程与生物制药重点实验室紫外诱变原始黑曲霉菌株筛选出来,菌种在4°C条件下保存在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上。1.1.2基础发酵培养基:称取五倍子粉和麸皮共5.0g装入250mL的三角瓶作为培养基基础,其中五倍子含量为8%,加入1%(W/W)NH4NO3,0.1%(W/W)MgSO4·7H2O,0.1%(W/W)NaCl,5mL蒸馏水,搅拌均匀。1.1.3主要仪器与设备:UV2550紫外可见分光光度计,恒温培养箱。1.1.4主要试剂:没食子酸丙酯购于湖南省张家界贸源化工有限公司,绕单宁由上海君创化工有限公司生产,五倍子产于贵州省遵义市余庆县,试剂均为化学纯。1.2方法1.2.1固体发酵方法:1)常规灭菌发酵。基础发酵培养基配好后,于1×105Pa高压蒸汽灭菌20min,冷却后在5g培养基中接种1mL黑曲霉B0201孢子悬液(1×108个孢子/mL),混匀后置于30°C培养箱中静置培养96h。2)生料发酵。基础发酵培养基配好后,不经高压蒸汽灭菌,直接在5g培养基中接种1mL黑曲霉B0201孢子悬液(1×108个孢子/mL),混匀后置于30°C培养箱中静置培养96h。1.2.2粗酶液提取:取出培养96h的三角瓶,在三角瓶中加入100mLpH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,30°C条件下150r/min振荡浸提1h,用定性滤纸过滤即得粗酶液。1.2.3酶活检测方法:根据文献[12]的方法测定单宁酶活力。单宁酶在pH5.0、30°C条件下每分钟产生1μmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。1.2.4常规灭菌发酵和生料发酵的比较:比较常规灭菌发酵和生料发酵对培养基和菌株生长的影响及对产单宁酶的影响。并优化在2种发酵条件下五倍子含量(4%~35%),初始加水量(液固比0.6:1~2:1)对产单宁酶的影响。所有发酵都作3个平行。1.2.5五倍子生料发酵条件优化:在五倍子生料发酵的培养条件下,优化各个培养参数,采用不同的培养温度(25°C~40°C),不同的接种量(0.1mL~2.5mL),改变培养初始pH值(3~8),除诱导物之外添加额外碳源(葡萄糖,淀粉,玉米粉),选取不同氮源(NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4、黄豆粉、蛋白胨、尿素)取代NH4NO3,添加不同的磷酸盐和钙盐,考察对该菌产酶的影响。所有发酵都作3个平行。1.2.6两种发酵条件下产单宁酶的时间曲线:在常规灭菌发酵和生料发酵单因素优化的基础上将该菌株培养(0~168h),研究单宁酶活力随时间的变化情况,比较产单宁酶活力。所有发酵都作3个平行。李秧针等:黑曲霉B0201利用五倍子固体发酵产单宁酶的条件研究1125结果与讨论2.1两种发酵方法对培养基和菌株生长的影响改变基础发酵培养基中五倍子含量,分别按常规灭菌发酵和生料发酵生产单宁酶,两种发酵方法对培养基性质和菌株生长的影响见表1。从表中可以看出培养基中五倍子经高温灭菌容易焦化,变性,对黑曲霉菌株的生长产生危害,在高浓度时导致黑曲霉不能生长。而未经高温灭菌时培养基没被破环,黑曲霉生长旺盛,且无杂菌的生长痕迹。这说明了以中国特产五倍子为诱导物生产单宁酶时生料发酵更适合于黑曲霉生长。表1常规灭菌发酵和生料发酵对培养基和菌株生长的影响Table1Effectofconventionalsterilefermentationanduncookedmaterialfermentationtomediumandgrowthofstrains五倍子含量Contentofgallnut常规灭菌发酵Conventionalsterilefermentation生料发酵Uncookedmaterialfermentation8%培养基经高温灭菌后有少量焦化颗粒;培养96h后黑曲霉生长旺盛培养基无焦化无破坏;黑曲霉生长旺盛,无杂菌生长25%培养基部分焦化;黑曲霉生长较好同上50%培养基焦化严重;黑曲霉部分生长同上75%培养基完全焦化,粘稠;无黑曲霉生长同上100%培养基完全焦化,粘稠;无黑曲霉生长有点粘稠,黑曲霉生长较好2.2两种发酵方法对产单宁酶的影响基础发酵培养基中诱导物五倍子含量为8%,分别按常规灭菌发酵和生料发酵生产单宁酶,两种发酵方法产单宁酶的活力如表2。从表中可以看出,采用生料发酵,单宁酶活力从常规灭菌发酵的14.0U/gds(Gramdrysubstrate每克培养基干重)提高到了18.2U/gds。采用生料发酵新方法生产单宁酶,培养基中无杂菌生长,单宁酶活力有了较大的提高,而且简化了生产流程,说明黑曲霉B0201利用五倍子生料发酵产单宁酶在实践上也是可行的,比常规灭菌发酵优越。表2两种发酵方法对产单宁酶的影响Table2Effectofthetwomethodstoproducetannase发酵方法Methodsoffermentation酶活(U/gds)Enzymeactivity(U/gds)常规灭菌发酵Conventionalsterilefermentation14.0生料发酵Uncookedmaterialfermentation18.22.3两种发酵方法下五倍子含量对产单宁酶的影响改变基础发酵培养基中五倍子含量,分别按常规灭菌发酵和生料发酵生产单宁酶,两种发酵方法下产单宁酶的活力如图1所示。图1a中采用常规灭菌发酵,当五倍子含量为8%时单宁酶活力最高,为14.0U/gds。随着五倍子含量的增加酶活力反而下降,究其原因可能是由于随着五倍子含量的增加,pH值减小,培养基中pH值减少影响单宁酶的产生,另一个原因是五倍子含量较大时,高压蒸汽灭菌对五倍子的破坏程度越重,对产单宁酶的影响也越大,这图1常规灭菌发酵和生料发酵时五倍子用量对产单宁酶的影响Fig.1Effectofgallnutcontentonproductionoftannaseunderconventionalsterilefermentationanduncookedmaterialfermentation注:a:常规灭菌发酵;b:生料发酵.Note:a:Conventionalsterilefermentation;b:Uncookedmaterialfermentation.1126微生物学通报2009,Vol.36,No.8图2常规灭菌发酵和生料发酵时加水量对产单宁酶的影响Fig.2Effectofinitialmoisturecontentonproductionoftannaseunderconventionalsterilefermentationanduncookedmaterialfermentation注:a:常规灭菌发酵