黑木耳多糖在食品工业中的应用

黑木耳多糖在食品工业中的应用第一章研究目的及意义第二章黑木耳多糖的理化性质及功能2.1黑木耳多糖的化学结构2.2黑木耳多糖的生理活性2.3黑木耳多糖的构效关系2.4黑木耳多糖的分子修饰第三章黑木耳多糖的提取纯化方法3.1提取方法3.2纯化方法第四章黑木耳多糖在食品中的应用第五章分析与讨论（全文总结加应用前景分析）第一章研究目的及意义黑木耳多糖作为一种生理活性物质，近年来日益受到人们的重视。黑木耳（AuriculariaAuricular）又称木耳、耳子、光木耳，属真菌门担子菌纲的食药用菌，它是生长在朽木上的一种腐生菌，由菌丝体和子实体两部分组成。菌丝体为无色透明，生长在朽木里面；子实体则生长在朽木的表面，为食用部分。我国是世界上主要的黑木耳生产国，年产量占世界总产量的90%以上，它在我国多数地区都有生产，这就为黑木耳的开发应用提供了有利条件。黑木耳脆嫩可口，营养极为丰富，有素中之荤的美誉。吴瑞宪【1】对黑木耳的营养成分作了全面的分析，发现它富含大量的糖类和蛋白质，同时也是一种钙和铁含量较高的食品。大量研究表明，黑木耳作为生物应答效应物（BiologicalResponseModifier，简称BRM）具有多种生理功能，而这些重要的生理功能都是与其多糖组分密切相关的。因此，黑木耳多糖备受人们青睐，对其的研究也已成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域的研究和开发应用的热点。第二章黑木耳多糖的理化性质及功能2.1黑木耳多糖的化学结构黑木耳多糖的结构分析包括单糖的组成、连接点类型、单糖与糖苷键的构型、分子量范围等。Misaki.等从黑木耳子实体中分离得到了4种多糖：FⅠA、FⅠB、FⅡ和FⅢ，并指出FⅠA及FⅡ均为酸性杂多糖，二者均由D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸组成。FⅠA的组成摩尔比依次为1.0∶4.1∶1.3∶1.3，FⅡ依次为1.0∶2.1∶1.0∶0.6。它们的结构是主链为α-（1→3）甘露聚糖，在部分甘露糖2，6位上被D-木糖、D-甘露糖或D-葡萄糖醛酸取代。另外两种多糖FⅠB、FⅢ主链均为β-（1→3）-D-葡聚糖，侧链与主链以β-（1→6）键接而成，二者的区别在于侧链的数目和类型不同：FⅠB在主链上约有2/3的葡萄糖残基被单个葡萄糖基取代，这种多羟基基团的存在使其在水中的溶解度较高，为水溶性。而FⅢ在主链上约有3/4的葡萄糖残基被短链葡聚糖残基取代，其分支度比FⅠB高，这种复杂的多分支结构使其在水中的溶解性很差，为水不溶性。同时他们测得FⅡ的分子量为50×104，FⅠB的分子量为140×104。Ukait等用热水和热乙醇从黑木耳子实体中分离得到两种酸性杂多糖：MEA和MHA。并证明了它们均由D-葡萄糖醛酸、D-木糖和D-甘露糖组成，MEA的组成摩尔比为1.0∶0.5∶2.8，MHA为1.0∶0.6∶1.0，两者都含有少量的D-葡聚糖，MEA和MHA的主链均为α-（1→3）键接的D-甘露吡喃糖，在部分甘露糖的2位上被β-D-葡萄糖醛酸取代，还有一些2和6位上被短链β-D-木糖取代。他们用沉降法测得MEA和MHA的分子量分别为30×104，37×104。以上两者的结果不尽相同，这可能是由于试验方法和条件的不同或由于试验所选用的黑木耳存在种属差异。但总的说来，黑木耳多糖所含有的多糖组分主要有D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸。其酸性杂多糖的分子量范围在30×104～50×104之间2.2黑木耳多糖的生理活性黑木耳是一种常见的大型药食两用真菌，其主要功能性成分为多糖,具有降血脂、抗凝血、抗肿瘤等多种生理活性。黑木耳多糖具有多种生物活性，而且不同化学结构和不同构象的黑木耳多糖组分表现不同的生理活性。经研究发现，黑木耳多糖对细胞免疫和体液免疫功能具有良好的促进作用，具有抗白细胞降低、抗肿瘤、抗辐射、抗突变、抗炎症等细胞保护作用；具有降低血脂、胆固醇、血液粘度，抗血栓形成作用；具有降低血糖、抗糖尿病以及降低脂褐质含量，增强SOD活力，减少有害物质自由基产生的功能；同时还能促进核酸、蛋白质的生物合成和防治多种老年性疾病。2.3黑木耳多糖的构效关系对于生物多糖的(1→3)—β—D—葡聚糖结构与抗肿瘤活性的关系,很早就有大量的研究,Misaki发现水溶性较好的葡聚糖I具有(1→3)—β—D—葡聚糖主链,其中0—6位上有适当的单个葡萄糖基分支,对肿瘤有较好的抑制作用,而葡聚糖Ⅱ组分在结构上有较多的葡萄糖短链分支,因此水溶性较差,对小鼠肿瘤却没有抑制活性;若将后者经高碘酸盐氧化,硼氢化物还原,再用弱酸水解得理,可以将水不溶性的、分支较多的β—D—葡聚糖组分降解,使之生成一种水溶性较好的经过修饰的多羟基葡聚糖,这种多羟基葡聚糖能够表现了抗肿瘤活性.这里需要指出的是,黑木耳多糖中的葡聚糖成分的抗肿瘤活性不仅与其在水中的溶解度有关,还与其侧链所连接的基团有密切的关系.同样水溶性较好的O—(羧甲基)—D—葡聚糖的抗肿瘤活性虽然比葡聚糖Ⅱ有所提高,但是却比不上经过修饰的多羟基葡聚糖的活性高.经过修饰的多羟基葡聚糖除了能抑制S———180肿瘤还有抗其他可转移肿瘤(transplantabletumor)和一些共生肿瘤(syngenictumor)的活性,例如埃利希癌.黑木耳多糖中的酸性杂多糖成分虽然没有明显的抗肿瘤活性,但是该组分的提高免疫功能、抗衰老和防治心血管疾病等作用却很明显,而且毒性低.黑木耳酸性杂多糖一般由D—木糖、D—甘露糖、D—葡萄糖和D—葡萄糖醛酸组成,其中糖醛酸含量一般占酸性杂多糖的10%～20%,它与黑木耳多糖的分子量变化规律相同,即分子量小的酸性杂多糖中糖醛酸的含量低,溶解度大.黑木耳酸性杂多糖具有明显的提高机体免疫能力的功能.其中促进白细胞数增加作用同酸性杂多糖的分子量和糖醛酸的含量有关,并且随着分子量和糖醛酸含量的降低,升白细胞效果大.该多糖的抗凝血的作用也很明显,抗凝血活性随多糖分子量和糖醛酸的含量降低而增大.用超声波辐射处理黑木耳的酸性杂多糖,制备一系列预定分子质量的黑木耳酸性杂多糖.经研究发现用超声波处理后的酸性杂多糖分子所发生的降解是不可逆的,也不存在分子间缔合现象.超声辐射未引起糖醛羧基的破坏,因而保证糖醛酸的含量维持不变,从而可保证超声辐射后其生理活性也不会丧失.,也可按重沉淀分级法对酸性杂多糖分级.以制备特定分子量的酸性杂多糖组分.2.4黑木耳多糖的分子修饰黑木耳（Auriculariaauricula（L．exHook．）Underwood）隶属于真菌门、担子菌纲、木耳目、木耳科、木耳属，是著名药食兼用真菌，其主要活性成分—黑木耳多糖具有抗肿瘤、抗血栓、抗衰老、降血糖、降血脂、调节免疫等功能。本文以黑木耳多糖为对象，系统地研究了其分级方法以及分子修饰（硫酸酯化、超声波辐射降解与过渡金属离子的相互作用）方法，通过对黑木耳多糖及其分子修饰多糖功能（抗氧化、抗肿瘤、抗凝血）研究，并探索其在膜材料上的应用，为黑木耳多糖、修饰多糖在医药、保健品、食品及膜材料等方面的应用奠定基础。得到以下主要结果：1、用阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）对黑木耳多糖进行分级，得到黑木耳中性多糖和酸性多糖（AAP）两部分，其中酸性多糖含量占80.33％，中性多糖占18.67％。用乙醇将黑木耳多糖分为AAP1、AAP2、AAP3三部分。2、确定了黑木耳多糖的最佳硫酸酯化工艺：氯磺酸与吡啶体积比5:1；多糖溶液与酯化试剂的体积2:1：酯化温度为50℃，酯化反应时间为1.5h。FTIR光谱显示硫酸基与AAP形成硫酸酯化合物。并制备了取代度分别为0.32、0.64、1.0的三个黑木耳多糖硫酸酯AAP-S1、AAP-S2、AAP-S3。3、黑木耳多糖（AAP）对ZnSO4·7H2O中Zn（Ⅱ）的螫合能力最强，其最佳螯合工艺为：Zn（Ⅱ）的初始浓度为3mg/mL、pH值为4.0、黑木耳多糖与Zn（Ⅱ）的比值为4:1、螯合6h。制备了黑木耳多糖（AAP）与5种过渡金属离子(Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+)的螯合物。4、黑木耳多糖经超声波辐射降解后，随时间的增加，黏度逐步降低、溶解性增加，葡萄糖醛酸含量基本保持不变。黑木耳多糖经超声波辐射20min、40min、60min后，制备了三种多糖AAP-US1、AAP-US2、AAP-US35、硫酸酯化黑木耳多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有不同程度的抑制，抑制作用可达16～20h。对黑曲霉的孢子萌发也有一定的抑制现象。AAP-S有直接清除氧自由基及提高机体抗氧化的功能。在生物体内可以通过显著地提高SOD、GSHPX、T-AOC的活力，降低MDA的含量，提高机体非特异性免疫器官—胸腺、脾脏的重量等作用，达到清除自由基的功能。硫酸酯化黑木耳多糖对肿瘤细胞表现出显著的抑制功能，并表现出量效关系，对癌细胞的最大抑制率出现在72h，可达49.6％。抗凝血活性存在量效关系，并随硫酸化取代度的增加，抗凝血活性逐渐增强。6、超声波改性黑木耳多糖对除羟自由基、超氧离子自由基均有一定的清除作用；对小鼠的生长无明显不良影响，并可以显著地促进胸腺和脾脏的生长；可以不同程度地提高小鼠血清T-AOC的能力、升高SOD、GSH-PX的活力、降低MDA含量。其抗氧化能力呈量效关系，即随剂量的增加，抗氧化能力逐渐提高。第三章黑木耳多糖的提取纯化方法3.1提取方法3.1.1热水浸提法热水浸提法是一种国内外常用的用于提取真菌类多糖成分的传统方法。陈艳秋【2】等采用热水浸提法对黑木耳子实体水溶性多糖的提取工艺进行了深入研究,并得出如下结论:黑木耳子实体干粉与水之比为1:50,在90℃水浴中抽提3.5h,提取液用70%乙醇醇析,在此工艺条件下多糖得率最高。之后,林敏等【3】同样采用此法提取黑木耳中的水溶性多糖,探索热水提取黑木耳多糖的最佳工艺条件,得出了与陈艳秋等人相近的结果。此法所需提取剂蒸馏水经济易得,但是需经多次浸提,得率仍然很低,而且费时费料。3.1.2稀碱浸提法包海花【4】等采用黑木耳粉用不同的提取剂(蒸馏水和1mol/LNaOH溶液)在其它条件相同的情况下对黑木耳进行提取时发现,后者的多糖含量比前者高出近3倍,且能节省时间和减少原材料及试剂的消耗。虽然碱处理使多糖含量增加,但寡糖含量则相对减少,且提取后液体需要中和,程序繁琐【5】。3.1.3酸浸提法黑木耳置0.3mol/LHCl溶液中,于50℃加热1.5h,其他步骤同“热水浸提法”,得黑木耳多糖8.4g,收率为16.8%。3.1.4酶解提取法近年来,一些学者致力于酶法提取食药用真菌多糖的研究,所谓酶法即采用酶与热水浸提法相结合的方法,酶多采用一定量的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶,此法具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。主要的方法有:单一酶法、复合酶法和分别酶法。姜红等【6】研究了纤维素酶和果胶酶各自分别作用提取黑木耳多糖的最佳工艺条件,发现在两种酶反应体系中,最适工艺参数较为接近,为黑木耳双酶水解提供了依据。张立娟等【7】通过单因素和正交试验研究了细胞破壁酶(纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶)在黑木耳多糖提取中的最佳作用条件,他们先加入复合酶(纤维素酶与果胶酶)作用,再加入蛋白酶反应。结果发现采用此法提取率高达16.83%,提取时间缩短到140min,较以往的热水浸提法和碱法提取具有明显的优点。3.1.5超声波提取法随着现代科学技术的发展,超声波技术已经应用于天然植物及真菌活性成分的研究。研究表明,利用超声波产生的高频振荡、高加速度和强烈的“空化效应”及搅拌作用,可加速有效生物活性成分进入溶剂,从而提高提取率,缩短提取时间、节约溶剂、并可在低温下提取,有利于有效成分的保护。此法在黑木耳多糖的提取中也得到了很好的应用。唐娟等【8】采用超声波协同纤维素酶法提取黑木耳多糖,确定了此法的最佳工艺条件,发现由于作用温度低,所得到的多糖颜色浅,因此有利于多糖产品的进一步精致。3.1.6微波辅助提取法利用微波强化固液浸取过程是一种颇具发展潜力的新型辅助提取技术。它具有设备简单、适用范围广、提取率高、节省溶剂、节省时间、节能、