外源基因的原核表达系统

外源基因的原核表达系统2014-12-1提高外源基因表达水平的措施提高外源基因的表达效率，一般要考虑以下几个原则1.优化表达载体的设计在构建表达载体时，对决定转录起始的启动子序列和决定mRNA翻译的SD序列进行优化，要求SD序列与翻译起始位点AUG的距离要合适，这样才能获得目的蛋白的高水平表达。2.避免使用稀有密码子密码子具有简并性，大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现出较大的偏爱性，同义密码子使用的频率与细胞内相应的tRNA的丰度正相关，稀有密码子的丰度极低。在mRNA的翻译过程中，往往会由于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的tRNA供不应求，最终造成翻译终止或移码突变。3.提高外源基因mRNA的稳定性多数情况下，细菌的mRNA的半衰期很短，而外源基因mRNA的半衰期更短，若能增加外源mRNA的稳定性，就有可能提高外源基因的表达水平。4.提高表达蛋白的稳定性，防止其降解原核细胞中外源蛋白往往不够稳定，易被蛋白酶降解从而使蛋白质产量降低。采取措施提高目的蛋白的稳定性，减少目标蛋白的降解从而提高目的基因的表达水平。5.减轻细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平外源基因在宿主细胞内过度表达，必然影响宿主细胞的生长和代谢，而宿主细胞的代谢失常又会影响目标蛋白的表达。采取诱导表达和讲宿主菌生长和表达质粒的复制分开等方式，平衡宿主细胞生长于目标蛋白表达这二者之间的矛盾。6.优化发酵条件在进行工业化生产时，工程菌株在大规模培养时培养条件的优化控制对外源基因的高效表达至关重要。优化发酵过程既包括工艺方面的因素，也包括生物方面的因素。利用原核表达系统生产真核蛋白质的实例干扰素基因工程干扰素是一类多功能蛋白质，具有抗病毒、抗肿瘤、抗细胞分裂以及调节免疫功能的作用，因而通过基因工程生产干扰素具有重要的意义。人的干扰素有3类：（α）白细胞干扰素、（β）成纤维素干扰素、（γ）免疫干扰素。目前，白细胞干扰素和成纤维素干扰素基因的结构基本了解：5’端有一段非翻译序列，紧接着一段先导序列，其后是干扰素基因，编码166个氨基酸，再后是3’非翻译区，末端是多聚A。IFN-cDNA的制备分级分离把不同部分的mRNA分别注射到爪蟾卵母细胞中从诱发产生干扰素的白细胞中提取mRNA检测干扰素抗病毒活性活性最高的mRNA反转录成cDNAIFN-cDNA的修饰在cDNA两端连接EcoRI识别序列，并在5’端连上信号序列。IFN-cDNA克隆修饰的cDNA与表达载体pBR322或YEpIpT连接，形成重组载体，转化大肠杆菌，表达分泌干扰素。我国科技工作者研制干扰素领域已获得成功，通过基因工程生产的人αI型干扰素已于1990年正式投放市场。生长激素基因工程人生长激素来自垂体，作为药物可以用于治疗儿童的侏儒症、烧伤、伤口愈合，以及预防老年患者肌肉萎缩等。前体生长激素的N端有一段23个氨基酸的信号肽，去掉信号肽之后就可以成为成熟的生长激素。在体外人工合成了起始密码ATG与编码前1-23个氨基酸的DNA片段并用反转录酶法合成了编码24-191个氨基酸的DNA序列，将两者连接后，转入大肠杆菌成功表达。hGH编码的前24个氨基酸的DNA片段克隆先人工合成6个小片段U1-U6，再依次将6个片段连接为一个较大的片段，该片段两端分别为EcoRI和HindIII黏性末端。利用酶切位点与pBR322相连，形成重组载体，转化大肠杆菌进行扩增。hGH编码24-191个氨基酸的DAN片段克隆利用反转录酶法，从人垂体提取mRNA反转录成cDNA，再合成第二链，用HaeIII切割，利用琼脂糖凝胶电泳分离纯化551bp的DNA片段，经末端转移酶的作用在3’端加入多聚C尾，再在pBR322上加入多聚G尾，使二者重组，对大肠杆菌进行转化，扩增。hGH基因的克隆将两部所得质粒酶切，连接，重组到含有LacUR-5启动子和四环素标记的载体上，转化大肠杆菌，筛选，表达。生长激素释放抑制因子基因工程生长激素释放抑制因子来自哺乳动物的下丘脑。主要抑制生长素、胰岛素、胰高血糖素等多种激素的产生，可以用于治疗肢端肥大症、胰腺炎、糖尿病等。将人工合成的生长激素释放抑制因子基因连在pBR322上并加上了乳糖操纵子调控，重组分子含有氨苄青霉素抗性以及乳糖发酵标记。基因产物不易被细胞内源性酶消化。将人工合成的生长激素抑制因子基因转进大肠杆菌细胞，并得到了基因产物，这是人类首次实现了真核基因在原核细胞中的表达。胰岛素基因工程胰岛素是一种蛋白质类激素,体内胰岛素是由胰岛β细胞分泌的。在人体十二指肠旁边，有一条长形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布着许许多多的细胞群，叫做胰岛。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗。胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。胰岛素立体结构胰岛素的性质〖化学本质〗蛋白质〖分子式〗C257H383N65O77S6〖分子量〗5807.69〖性状〗白色或类白色的结晶粉末〖熔点〗233℃（分解）〖比旋度〗-64°±8°(C=2,0.003mol/LNaOH)〖溶解性〗在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶；在矿酸（无机酸）或氢氧化碱溶液中易溶〖酸碱性〗两性，等电点pI5.35-5.45胰岛素的英文缩写，INS.（insulin）胰岛素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现1955年英国F.桑格小组测定了牛胰岛素的全部氨基酸序列1965年9月17日，中国科学家人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素，它是第一个在实验室中用人工方法合成的蛋白质胰岛细胞根据其分泌激素的功能分为以下几种：①B细胞(β细胞)，约占胰岛细胞的60%～80%，分泌胰岛素，胰岛素可以降低血糖。②A细胞(α细胞)，约占胰岛细胞的24%～40%，分泌胰升糖素，胰升糖素作用同胰岛素相反，可增高血糖。③D细胞，约占胰岛细胞总数的6%～15%，分泌生长激素抑制激素胰岛素生物合成的控制基因在第11对染色体短臂上。在β细胞的细胞核中，第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA从细胞核移向细胞浆的内质网，转译成由105个氨基酸残基构成的前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成86个氨基酸组成的长肽链——胰岛素原。胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，经蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三个精氨酸连接的链，断链生成没有作用的C肽，同时生成胰岛素，分泌到β细胞外，进入血液循环中。未经过蛋白酶水解的胰岛素原，一小部分随着胰岛素进入血液循环。胰岛素的分类动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素生物合成人胰岛素：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同胰岛素基因的克隆表达鼠胰岛素原cDNA连在pBR322上，转化大肠杆菌进行克隆；人的胰岛素DNA将A肽和B肽的DNA片段分别于pBR322相连，通过对大肠杆菌转化儿进行克隆；鼠胰岛素使用PL启动子，基因产物为融合蛋白，在β-内酰胺酶信号肽的作用下，穿过胞膜分泌到胞外。人胰岛素使用β-半乳糖苷酶启动子，表达融合蛋白β-半乳糖苷酶-A肽，β半乳糖苷酶-B肽，经溴化氢处理后，得A肽与B肽，通过双硫键的结合，成为成熟的人胰岛素分子。α-淀粉酶基因工程α-淀粉酶普遍应用于食品、酿造、轻工业纺织、造纸、制药等工业中。热稳定α-淀粉酶已逐步取代中温α-淀粉酶，并由微生物进行生产。通过基因工程的手段，将地衣芽孢杆菌的热稳定α-淀粉酶基因转移到枯草杆菌中，可以显著提高产量。