蛋白表达概述

蛋白表达概述MichaelChao常用蛋白表达系统(host)原核细胞：大肠杆菌。真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞大肠杆菌表达系统大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解；②商品化的载体和菌株种类非常齐全；③表达效率高；④易培养，成本低。缺点：①因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体；②蛋白质不能糖基化；③其内毒素很难除去。酵母表达系统甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统，以PichiaPastoris应用最多。优越性：①蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白；②表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，实现高效率表达；③表达载体都为E.coli/PichiaPastoris的穿梭载体，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量扩增。④易培养，成本低,可高密度发酵。缺点：①糖基化与哺乳动物有所差别；②培养上清多糖浓度高，不利于纯化。昆虫细胞表达系统利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。优越性：①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；②可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体；③可进行分泌表达。缺点：①糖基化与哺乳动物有所差别；②表达量有限；③作为药物宿主细胞未被FDA认可；④培养成本高。哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。优越性：①糖基化与人源蛋白一致；②能表达天然结构的完整蛋白，活性很高；③可进行分泌表达。缺点：①表达量低；②培养成本很高，操作繁琐。各种表达系统各有其优缺点，大肠杆菌和酵母表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与昆虫细胞、哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需要表达的蛋白是否有毒性，是否有活性，是否需要糖基化，还需要考虑成本、产量及纯化路线和安全性。对于我们来说，最常用和最需掌握的是大肠杆菌表达系统FactorsinE.coliproteinexpressionStrainvectorgrowthconditions一个蛋白要成功的在E.coli系统表达，就是要根据表达目的在载体，菌株和培养条件三个主要因素之间找到一个理想的结合点。以达到⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。表达载体(Vector)原核表达载体众多，常用的有pET(T7promoter)、pQE(T5promoter)、pGEX(GST融合表达)等。各载体适应的菌株也不尽相同pET(BL21(DE3))、pQE(M15,JM109)、pGEX(BL21)。对于我们来说，最常用和最需掌握的是pET表达系统ExpressionplasmidfeaturesInductionofexpressionpET载体E.coli表达蛋白流程pETsystemFetures:popularLowbasalexpressionlevelsWidestvarietyoffusiontagsSpecializedvectorsandhostsCompetentcells选择合适的载体载体大致可分为两大类：转录载体和翻译载体。转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起始密码子的目的基因。只有3种转录载体：pET-21(+)、pET-24(+)和pET-23(+)。翻译载体包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达那些不带有核糖体结合位点的目的基因选择合适的载体需要考虑的因素：目的蛋白的应用目的蛋白已知特定信息克隆策略目的蛋白的应用分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制备抗原等。大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。可能有多种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是，能用于大量纯化的载体-宿主菌-培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。如果要连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体-宿主菌-培养条件的组合以便找到最佳条件，是非常值得的。目的蛋白的已知特性任何有关目的蛋白的信息都有助于选择合适的载体。例如，有些蛋白表现活性要求一端或两端均无外源序列。大多数pET载体可以克隆非融合序列；但是，如果特定翻译起始序列在E.coli中不能被有效使用，表达水平也会受到一定的影响。在这种情况下，通常是构建一种带有高效表达的氨基末端序列的融合蛋白，并在纯化完成后用特定的蛋白酶切去融合序列。克隆策略不同的克隆策略、对限制性酶切位点及阅读框的不同要求，会影响对载体的选择。许多pET载体具有同样的限制性酶切位点，那么可以仅准备一次目的插入片段，将其插入到多个载体中。不同的要求可以考虑采用不同的PCR克隆策略。蛋白溶解性和细胞定位一旦确定了用途和克隆策略，下一步就是判断目的蛋白在细胞中的定位和可溶性。许多后续应用要求目的蛋白以有活性的可溶状态表达。大多数情况下，可溶性并非有或无的现象。正确选用合适的载体和宿主菌组合会明显提高目的蛋白可溶部分比例及活性。载体可以通过三种方式增加可溶性：1)与本身溶解性高的多肽序列融合表达(GST，Trx及NusA)；2)与催化二硫键形成的酶融合表达(例如Trx，DsbA，及DsbC)；3)与信号序列融合表达，输出到细胞周质。包涵体有利于纯化：容易通过离心收获浓度高而相对纯净的蛋白；包涵体保护蛋白免受蛋白酶水解；毒性蛋白以无活性的包涵体形式表达，不会影响宿主菌的生长。有意采用包涵体复性方法多用于制备抗原或用于不特别要求正确折叠的应用情况。pET-17xb以N端融合蛋白形式表达全长220aaT7基因10蛋白，并形成包涵体。pET-31b(+)也是表达融合蛋白包涵体的代表，非常适合制备小蛋白和多肽。非融合表达，融合表达，分泌表达PSDForeignDNAPSDForeignDNA融合表达载体融合基因PSD融合型表达载体ForeignDNA融合基因IPPS•Tag，T7•TagGST•Tag，His•TagTrx•Tag，Nus•TagpET载体的融合标签E.coli宿主菌名称特征用途抗性DH5α带有recAendA突变的克隆菌株，由于DH5α具有deoR变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。常用的质粒抽提工程菌株,可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。无BL21lon和ompT蛋白酶缺陷型用于PGEX载体构建质粒的蛋白表达无BL21(DE3)lon和ompT蛋白酶缺陷型，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7RNA聚合酶基因用于含有T7的pET系列载体构建质粒的蛋白表达无BL21(DE3)-RP在BL21(DE3)细胞的基础上，具有额外拷贝的argU和proL基因解决了表达富含AT的基因组蛋白密码子偏倚性问题氯霉素BL21(DE3)-RIL在BL21(DE3)细胞的基础上，具有额外拷贝的argU、ileY和leuWtRNA基因解决了表达富含AT的基因组蛋白密码子偏倚性问题氯霉素BL21(DE3)-plysS带有可以与pET共存的、编码T7溶菌酶（T7RNA聚合酶的天然抑制物）的质粒。pLysS菌株在被诱导前T7RNA聚合酶的基础表达被抑制，这样可以使表达会影响宿主细胞生长和活力的重组体在宿主中更稳定。带有pLacI质粒的宿主菌产生额外的抑制pETBlue和pTriEx载体基础表达的lac阻遏蛋白更严格的本底表达控制，适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。氯霉素BL21(DE3)-Rosetta-gami（Rosetta-gami）携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，又具有thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase(gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达补充7种稀有密码子，促进蛋白可溶性及表达活性卡那霉素、氯霉素、四环素Rosetta-Blue带有recAendAlacIq突变的克隆菌株,高蛋白表达,补充大肠杆菌缺乏的AGG,AGA,AUA,CUA,CCC,GGA六种稀有密码子对应的tRNA。补充稀有密码子，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平氯霉素用于克隆的宿主菌用于克隆的宿主菌通常是K12系列NovaBlue，JM109以及DH5a。这些菌株是recA–endA–型，转化效率很高，且质粒产量高，适合用于保存带有克隆目的基因的pET载体。用于表达的宿主菌重组质粒转化到带有染色体T7RNA聚合酶基因(T7gene1)的大肠杆菌中，即可开始生产蛋白了；所有B型菌株，B834，BL21，BLR，OrigamiB，Rosetta及Tuner都缺乏纯化过程中降解蛋白的lon蛋白酶及ompT外膜蛋白酶。因此，目的蛋白在这些菌株中的稳定性要高于带有这些蛋白酶的菌株。BL21(DE3)是用得最多的表达菌；AD494(DE3)和BL21trxB(DE3)具有trxB突变，而Origami(DE3)，OrigamiB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)菌株带有trxB和gor双突变。拥有trxB和gor突变的菌株比单具trxB突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高；多数氨基酸有不只一个密码子，而不同的生物使用这61种密码子的偏爱性不同。每种细胞里，tRNA种类和数量直接反映了其mRNA使用密码子的种类和数量的偏爱性。当外源目的基因mRNA在E.coli里过表达，由于密码子偏爱性不同，会因为缺乏某种或某几种tRNA，直接导致翻译终止或错误。tRNA不足会造成翻译停顿，早期翻译停止，移码突变，和氨基酸错掺等问题。Rosetta菌株是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有tRNA水平，这些蛋白的表达会大幅度提高。表达条件培养基；抗生素；诱导剂；诱导温度；诱导时机；诱导时间。培养基适于pET系统宿主菌生长及表达目的DNA的生长培养基种类很多，包括LB，TB，M9及M9ZB等抗生素和诱导剂氨苄青霉素作为一种选择性抗生素的应用需要相当小心，因为β-内酰胺酶的表达可以达到相当数量，并分泌到培养基中破坏所有的氨苄青霉素。另外由细菌代谢所造成的酸性环境也容易使氨苄青霉素水解。对于pBR322衍生质粒，一般采用50μg/ml氨苄浓度，当培养基变混浊时（10E7细胞/ml）也就意味着氨苄的失效。200μg/ml的氨苄浓度会使达到氨苄失效点的细胞浓度略有提高，但由于β-内酰胺酶的催化活性，即使加再多的氨苄也很难使细胞生长达到饱和时仍维持选择压力。表达条件优化增加可溶性和折叠；稀有密码子；毒性基因及质粒稳定性；其他因素。增加可溶性和折叠在许多应用中需要目的蛋白以可溶及活性形式存在(蛋白可溶并不意味着蛋白正确折叠)。载体、宿主菌、蛋白序列和培养条件都会降低或升高蛋白可溶/不溶形式的比例。在通常情况下，降低蛋白合成速率，如降低诱导剂浓度，降低诱导培养温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。温度：37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温(15-20℃)延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白的产量达到最大。裂解缓冲液的性质会大大影响到目的蛋白可溶与不溶形式之间的比例。当采用一般的裂解缓冲液如1×HisBindBinding缓冲液（包括500mMNaCl）时，一些包含疏水或膜相关结