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1第一章基因工程一、工具酶的发现和基因工程的诞生1、基因工程的概念：（1）广义的遗传工程：泛指把一种生物的遗传物质（细胞核、染色体脱氧核糖核酸等）移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。（2）基因工程：就是把一种生物的基因转入另一种生物体中，使其产生我们需要的基因产物，或者让它获得新的遗传性状。基因工程的核心是构建重组DNA分子。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。（3）基因工程诞生的理论基础：DNA是遗传物质的发现过程、DNA双螺旋结构的确立、遗传信息传递方式的认定。2、基因工程的基本工具（1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能切割（使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开），因此具有专一性。例如：某种限制性核酸内切酶能识别的序列是GAATTC,能在G和A之间切割DNA，如下图所示。黏性末端黏性末端③结果：能将DNA分子切割成许多不同的片段。备注：不同DNA分子用同一种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制性核酸内切酶切割，产生的黏性末端一般不相同。（2）“分子缝合针”——DNA连接酶①作用：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起（缝合磷酸二酯键）形成的DNA分子称为重组DNA分子。因此，DNA连接酶具有缝合DNA片段的作用，可以将外源基因和载体DNA连接在一起。（3）“分子运输车”——载体——质粒2①载体具备的条件：1）能在受体细胞中复制并稳定保存。2）具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。3）具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体——质粒：质粒在细菌中以独立于拟核之外的方式存在，是一种特殊的遗传物质，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒二、基因工程的原理和技术1、基因工程的基本原理：是让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细胞中稳定和高效地表达。为了实现基因工程的母版，通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按照一定的程序进行操作：目的基因的获得、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞（宿主细胞），筛选含有目的基因的受体细胞、基因表达。2：目的基因的获得：即获得我们所需要的基因，如人的胰岛素基因。（1）目的基因：是指能编码蛋白质的结构基因。（2）获得目的基因的两种方法：①目的基因的序列已知：用化学方法合成目的基因。如胰岛素基因或用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因②目的基因的序列未知：建立一个包括目的基因在内的基因文库，从基因文库中找到目的基因3、形成重组DNA分子：就是将目的基因与载体DNA连接在一起。通常是用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA（如质粒），就会在目的基因和载体DNA的两端形成相同的黏性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子。4、将重组DNA分子导入受体细胞用适当的方法将形成的重组DNA分子转移到合适的受体细胞中。常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。如用质粒作载体，宿主细胞应选择大肠杆菌，用氯化钙处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞。5、筛选含有目的基因的受体细胞：并不是所有细胞都接纳了重组DNA分子，因此需要筛选含有目的基因的受体细胞。采用选择性培养基筛选。36、目的基因的表达：目的基因在宿主细胞中表达，能产生人们需要的功能物质。三：本章总结：基因工程就是把一种生物的基因转入另一种生物体中，使其产生我们需要的基因产物，或者让它获得新的遗传性状。基因工程的核心是构建重组DNA分子。DNA是遗传物质的发现过程、DNA双螺旋结构的确立和遗传信息传递方式的认定是基因工程诞生的理论基础，而限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒载体的发现与应用，又为基因工程的创建提供了技术上的保障。基因工程的操作一步包括：目的基因的获得、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞（也称宿主细胞）、筛选含有目的基因的受体细胞核母妃基因表达。第二章克隆技术一、什么是克隆1、繁殖的方式：（1）有性繁殖：经过异性生殖细胞的结合，产生合子，再由合子发育成下一代个体的繁殖方式。（2）无性繁殖：不经过异性生殖细胞的结合，直接由母体产生下一代个体的繁殖方式。无限繁殖产生的个体保持了亲本的遗传性状，一次产生后代的数量可以很大，可以迅速扩大其种群的数量。2、无性繁殖系：个体通过无性繁殖可连续传代并形成群体，这样的群体称为无性繁殖系。克隆就是指无性繁殖系。3、克隆技术：是指才众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或特定类型细胞的操作技术。在分子水平上，基因克隆是指某种目的基因的复制、分离的过程；在细胞水平上，细胞克隆技术在利用杂交瘤制备单克隆抗体的技术中得到应用；在个体水平上，克隆技术就是一种通过单个细胞，特别是来自特定活体的单个体细胞进行无性繁殖从而产生新个体的过程或技术。基因克隆和细胞克隆是现代生物技术中的关键技术。从理论上说，由于细胞核具有基因组合全套遗传信息，生物的体细胞有潜力直接发育成胚胎和形成与核供体完全相同的个体克隆。4二、植物的克隆：1、细胞全能性（1）植物细胞全能性：指植物体的每个活细胞都具有遗传上的全能性，因而都具有发育成完整植株的潜能。原因：从理论上讲，每个细胞都包含该物种的全部遗传物质（全部基因），所以每个活细胞都应具有全能性。（2）植物细胞全能性的体现：全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞①植物细胞全能性表达能力强：实践表明，植物体的几乎所有组织（如根、茎、叶、花药、子房及幼胚等组织）的细胞，通过诱导都可再生新植株。即植物体的每个活细胞，即使是已经高度成熟和分化的细胞，都保持了恢复到分生状态的能力，都具有遗传上的全能性。所以植物的组织培养比动物更方便。②不同植物或同种植物不同基因型个体的细胞全能性有差异：由于不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间遗传性的差异，细胞全能性的表达程度大不相同。如拟南芥、烟草和番茄等能在多个世代中保持细胞全能性的表达；而小麦、要么和水稻等在多次继代培养后会丧失细胞全能性的表达能力。③长期培养中，细胞全能性表达能力下降的原因：1）遗传物质不可逆改变：染色体畸变、细胞核变异或非整倍体产生，且其结果不可逆；2）生长发育条件变化：细胞或组织中激素平衡被打破，或细胞对外源生长物质的敏感性发生改变；3）由于其他原因产生了缺乏成胚性的细胞系。④植物克隆成功所需的条件：1）深入探讨特定植物细胞全能性的表达条件（激素配比）；2）在植物克隆实验中，选择性状优良、细胞全能性表达充分的基因型。2.植物组织培养程序（1）概念：植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、生芽，最终形成完整的植株。（2）培养过程：离体的植物器官、组织或细胞―→愈伤组织―→试管苗―→植物体脱分化再分化离体的植物器官、组织、细胞愈伤组织根芽植物体愈伤组织：一种相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的新生组织。（细胞排列疏松、无规则）脱分化：已经高度分化的植物细胞，经过诱导重新恢复了分裂能力，产生愈伤组织的过程，又称去分化。再分化：脱分化产生的愈伤组织经培养，重新分化根或芽等器官的过程。组织培养具体过程：①配制含有适当营养物质和植物生长调节剂的半固体培养基（灭菌）；5②从消毒的根、茎或叶上切取一些小组织块；③将组织块放在培养基上培养，获得愈伤组织；（无需光）植物组织切口处的细胞在创伤的刺激下发生脱分化称为分裂的细胞，不断进行分裂增殖，在创伤表面形成一种由相对没有分化的活的的薄壁细胞团组成的新生组织，即愈伤组织。④以适当配比的营养物质和生长调节剂诱导愈伤组织，直到再生出新植株。（需要光）（3）培养基的营养成分：无机营养成分：水、矿质元素（全部），如硝酸盐、铵盐有机营养成分：1）碳源：蔗糖2）含N物质：氨基酸、维生素3）琼脂：0.7%—1%，起支持作用植物生长调节剂：细胞分裂素、生长素PH值：5.0－6.03、植物的克隆：（1）理论基础：植物细胞的全能性（2）技术基础：植物组织培养（3）主要技术：植物细胞培养；植物器官培养；原生质体培养4、植物细胞培养（1）概念：指以单个游离细胞为外植体的离体无菌培养。其目的是通过大规模的细胞培养以获得人类所需的细胞次级代谢产物。（2）采用技术：悬浮细胞培养：通过液体悬浮培养使愈伤组织分散成单细胞，经适宜培养基中成分的诱导，可从单细胞依次到细胞团、球形胚、心形胚和胚状体，最后而形成新植株。5、器官培养：（1）概念：指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养。（2）如何实现器官发生和形态建成：主要通过平衡的植物激素配比进行调控。1）诱导芽的分化：细胞分裂素＞生长素（激动素）2）诱导根的分化：生长素（IAA（吲哚乙酸）＞细胞分裂素（3）细胞培养和器官培养的意义：细胞培养和器官培养时，植物克隆的结果，不一定是植物，也可以是器官，甚至是细胞群(愈伤组织)。人们要的可以是植物，也可以是细胞或者是细胞代谢产物。6、原生质体培养：（1）概念：用纤维素酶或果胶酶水解细胞壁，获得球形的植物细胞原生质体（细胞中有代谢活性的原生质部分，包括质膜、细胞质和细胞核），用适当方法进行原生质体培养，也可获得新植株。（2）植物原生质体的获得方法：在0.5—0.6mol/L的甘露醇溶液环境（较高渗透压）下用纤维素酶和果胶酶混合液处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞，将细胞壁消化除去，获得球形的原生质体。6问题：为什么要加较高渗透压的甘露醇？原因：防止原生质体吸水胀破。7、植物体细胞杂交技术在原生质体培养成功的基础上，形成了体细胞杂交技术（原生质体融合）。（1）概念：植物体细胞杂交是指将来自两个不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的方法。（2）过程：（3）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。（4）融合完成的标志：新细胞壁的形成。（5）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。8、植物细胞工程：（1）概念：培养植物细胞（包括原生质体），借助基因工程方法，将外源遗传物质（DNA）导入受体细胞（包括原生质体）中或通过细胞融合、显微注射等将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株。9、植物组织培养的应用：试管苗的快速繁殖、无病毒植物的培育、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产、转基因植物的培育等。练习：（1）为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？答：基因在特定空间和时间条件下选择性表达的结果。在个体发育的不同时期，生物体不同部位的细胞表达的基因是不同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成了不同的组织和器官。（2）在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？答：避免杂菌在上面迅速生长消耗营养，且有些杂菌会危害培养物的生长。（3）列举植物克隆的成就：答：1）细胞培养：如人工种子的制造，细胞产物的工厂化生产2）器官培养：如无病毒植物的培育，试管苗快速繁殖3）原生质体培养和植物细胞工程：转基因植物培养、培养作物新品种7三、动物的克隆1、动物细胞、组织培养（1）动物细胞培养：就是从动物机体中取出相关的组织，经过机械消化或胰酶消化，使其分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生存、生长和繁殖。在某种程度上像体内一样呈现一定的组织特性。（2）动物组织培养：体外培养动物组织，使其维持生活状态或生长特性。可以伴随组织分化，但最终成为细胞培养。2、动物细胞培养过程：（1）培养条件：①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养