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食物中氨基酸含量的高效液相色谱法测定一、简介测定食物中氨基酸含量一般采用氨基酸分析仪，柱后衍生测定，但氨基酸分析仪价格昂贵，分析时间长，且只能用于分析氨基酸，限制了氨基酸分析技术的广泛应用。七十年代以来，柱前衍生高效液相色谱法开始应用于氨基酸的测定。液相色谱通用性强，检测灵敏度高,可用于多种物质的分析。南京科捷应用研究所采用柱前衍生紫外检测的方法对几种食物中的16种氨基酸进行了测定。二、LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪配置LC-10Tvp高压恒流泵：2台SPD-10Tvp紫外检测器：1台SCL-10Tvp系统控制器：1台7725i手动进样阀：1套色谱工作站：1套（VI2010、N2000、N3000选用）液相色谱柱：1支（C184.6*250mn,5um）微量进样器：1支（50ul/100ul）进样支架：1只（进样阀用）三、LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪特点LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪是南京科捷分析仪器有限公司为了快速地满足多样化的客户需求，在原有的STI501液相色谱仪的基础上经过优化，利用美国先进技术开发设计，国内加工生产的的一款新型的液相色谱仪。LC-10Tvp等度高效液相色谱仪实现了人机对话，可实时对仪器的运行状态进行监控，并可对潜在和已出现的故障做出判断，同时提供在线解决方案。该仪器也全面实现了远程的准无人操作，大大提高了仪器的使用效率，同时通过高精度的AS1000自动进样系统，实现自动化进样，最大程度抑制了样品的交叉污染，提供样品分析精度。LC-10Tvp等度高效液相色谱仪可广泛应用于研究开发、医药检验、食品检测、化工分析、环境监测等众多分析领域。主要特点丰富的功能——符合客户对分析的不同需求硬件具有VP功能，记录维护信息和操作记录，符合GLP/GMP要求；系统控制器增具有时钟、温度计、湿度计等人性化设计的功能。卓越的性能——满足客户对仪器的严格要求检测器采用进口氘灯、光电池以及1200条/mm凹面光栅组成的双光束单色器；精密加工的双透镜流通池，控制波长调节的高精度微处理器以及双路高速的采样频率，确保了低噪声、低漂移及超高灵敏度等特点。VI2010工作站符合多种法规要求。可靠的结果——满足客户对结果的准确要求与进口仪器做对比试验,分析结果具有高度的一致性。简便的操作——便于客户对软件的熟练操作软件采用多窗口模式，操作方便。精美的外观——满足客户对仪器的视觉要求外形精美，带来视觉上的享受。技术指标LC-10Tvp高压恒流输液泵输液方式微体积串联双柱塞最大输液压力0～9999Psi流量设定范围0.001～9.999ml/min（以0.001ml/min步长调节流量）流量设定值误差≤0.5%流量稳定性误差≤0.2%RSD压力脉动小于15Psi（流量1mL/min，压力600～1600Psi。）泵密封性压力为5400Psi，时间为10min，压降小于400Psi。时间程序功能有尺寸W260×H130×D420mm重量11kg使用环境温度范围4～40℃SPD-10Tvp紫外可见可变波长检测器波长范围190nm～700nm波长示值误差≤±1nm波长重复性误差≤±0.1nm动态噪声≤±0.75×10-5AU（甲醇，1ml/min，254nm，20℃。）静态噪音≤±0.5×10-5AU（空池，响应时间1秒，20℃。）动态基线漂移≤±1×10-4AU/h（甲醇，1ml/min，254nm，20℃。）静态基线漂移≤0.5×10-4（空池，响应时间1秒，20℃。）线性范围≥104最小检测浓度≤1×10-9g/mL（萘/甲醇溶液）定性重复性RSD6≤0.1%定量重复性RSD6≤0.5%光谱带宽6nm流通池体积8μL光程10mm时间程序功能有尺寸W260×H130×D420mm重量11kg使用环境温度范围4～40℃四、食物中氨基酸含量的检测方法1、试剂浓盐酸（优级纯），苯酚（分析纯），混合氨基酸标准液，含17种蛋白水解氨基酸，天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、撷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸，除胱氨酸浓度为1.25mmol/L外，其余16种氨基酸浓度各为2.5mmol/L流动相A,磷酸盐缓冲液用1：10双蒸水稀释，pH4.95。亦可自行配制，流动相B：乙睛，流动相C：双蒸水,硼酸盐缓冲液衍生试剂6一氨基喹琳基一N一羟基琥珀酞亚氨基甲酸酯，用时加入1mL乙睛,混匀于55℃烘箱加热10min至溶解2、仪器高效液相色谱仪：LC-10Tvp,紫外检测器：SPD-10Tvp真空泵超声波清洗器涡旋混合器。3、色谱条件色谱柱,色谱柱：高效C18色谱柱柱温：37℃检测波长：248nm进样量：10uL梯度洗脱条件,如表4、实验方法4.1衍生反应衍生试剂（AQC）与氨基酸迅速反应生成在248nm有紫外吸收的高稳定性的脲和羟基琥珀酰亚胺（NHS），过量的试剂可在慢反应中完全水解，过程如下4.2氨基酸衍生步骤用微量注射器移取10uL稀释的氨基酸标准液或样品水解液放人6(50mm样品管底部加人70uL硼酸盐缓冲液,涡旋混合10s)，边涡旋混合边加入20uL衍生试剂溶液，用封口膜密封样品管,置于55℃烘箱中加热10min，从烘箱中取出样品管冷却至室温,供分析用。此衍生样品于44.3样品水解精密称取适量样品约0.5-1.0g于水解管中,加入6mol/L盐酸10-15ml，加入少量新蒸馏的苯酚，抽真空，充高纯氮气，重复3次。迅速将已充好氮气的水解管拧紧盖子，放入110℃烘箱中水解22h。水解完毕，将水解液过滤，定容。取适量，于55℃减压干燥至干，再用适量二次蒸馏水复溶，备用。工作曲线制作将氨基酸标准液配制成浓度分100,200,400,600,800,1000umol/L的溶液，每一标准液取10uL依上法衍生后进行测定，色谱分离见图14.4结果与讨论回归方程根据工作曲线，以峰面积（A）与浓度（C）进行回归分析，回归方程结果见表2。各氨基酸的检测限为0.54umol/L五、结果南京科捷研发的采用柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸含具有准确，快速，灵敏度高等优点，此方法简便可行,无需购买昂贵的专用氨基酸分析仪器即可对氨基酸进行分析。