高效液相色谱法的应用

谢沐风上海市药品检验所[e-mail]请大家将手机调整到“振动”档！谢谢您的配合！授课内容（1）HPLC仪器的介绍，基础知识。（2）方法学验证中各项指标的深入剖析。（3）在新药申报资料中应注意的问题和事项。（4）从溶出度研究引申至国产口服固体制剂与进口原研制剂的差距。申请ANDA（美国仿制药申请）和OEM（制剂委托加工）的技术要点。（5）剖析中国药典中有待商榷之处，使大家举一反三、融会贯通！（6）为学员们解答各种问题。理念与思路工作中应注意总结，理论联系实际，重视文献的查询，不要匆匆忙忙地就进行试验，搞清楚原理，做好试验计划、设计好试验后，再有条不紊地进行。试验期间不要怕遇到问题，越是遇到问题，解决问题，提高得越快，如果长时间都没有问题，都“一帆风顺”，那将没有提高!理念与思路1）“搞分析”就是“搞误差”！2）只有把握住误差，才能科学、辨证地做到“知识的活学活用”！3）做到技术上的“粗放自如”、“张持有度”，需要不断地体会和领悟！信息查询国家药监局新药审评中心网站国家药品监督管理局网站国家药典委员会网站中国期刊网数字图书馆万方数据库HPLC仪的一般操作1.几大仪器生产厂商的介绍和使用下来的体会。包括国内目前可以生产的部件；根据自己工作需要购买某一品牌。2.流动相的配制（梯度洗脱）和处理（过滤膜）3.柱子的安装。4.操作顺序5.平衡时间6.如有气泡，如何处理。（1）分析生化样品、血液制品和手性色谱柱时，最好加一预柱以保护。（2）配备柱温箱，以保证试验的重现性和降低柱压等（3）最好能配一电脑和国产软件。不要用积分仪。（4）压力不稳时，绝大多数情况是有气泡混入。应排除。（5）试验后色谱柱冲洗。（6）色谱柱不用、存放时，两头柱塞一定塞住，否则容易挥发干损伤柱子。（7）建立仪器使用登记本。（8）仪器维修培养一位同志1．定义:HPLC——highperformanceliquidchromatography2．分析物质的分子量大小——分子量一般在200~1000之间，太大的分子量（如多肽类等）导致脱尾严重，此时可采用其他方法进行分析，如毛细管电泳，凝胶色谱等。3.分析的特点适用范围宽：现在决大部分化学类药品皆可采用该仪器分析。分离效率高：复方分析、辅料干扰时等情况下，更显示其威力。速度快：一般出峰时间均在30min以内。这里需要强调的是，通常采用流速为1.0ml/min，柱温30~40℃的测定条件。一般含量测定、溶出度可调整为出峰时间快一些，有关物质测定一般调整的慢一些，最好10~15min左右出峰为好。。流速和柱温均可适当改变，以适应测定的需要。如含量测定时，可适当加大流速和提高柱温；柱温降低和流速降低均可对分离效果提高。顺便提级：同样的测定条件，不同公司生产的色谱柱C18柱，出峰时间都有可能相差很大。这十分正常。目前国外已基本采用一根色谱柱对一个产品，特别是一些特殊的柱型，质量标准中均详细注明。国内虽做不到，但可在色谱条件上下工夫，以适应不同的色谱柱型号，即后面即将讲到的方法认证中的系统耐用性。灵敏度高：可检测物质达10-9g左右，一般最低检测浓度均可达10-1~10-3μg/ml（进样体积10~20μl）。这是紫外测定无法匹敌的。有些浓度非常低的，紫外检测不到或者说紫外无法测定的，应用HPLC法均可得到满意的解决！并可通过使用不同的检测器，测定不同物质，或再提高测定灵敏度。色谱柱可反复使用：一般保存好，均可达2年以上。流出的组分容易收集：可用于制备色谱或价格极为昂贵的物质收集。安全：仅有一些有机溶剂的污染（使用时，流动相口要密封，一者以免挥发，流动相中各组分比例不准，二者防止挥发，污染环境），比气相要安全的多。还有一个优点，就是成功率较高：一般条件确定好后，均可得满意的结果，这也是与气相、毛细管电泳比最大的优点。4．分离原理就是利用不同物质间的细微差别，使得在色谱柱上所显现的保留行为有所不同进行分离测定。主要是能够分离。两个主要参数：(1)柱效用理论板数来表达：22/1)(54.5WtnR2)60065.1(54.5HAtnR上面两式需要注意的是：第一个为基本公式，好的软件均可自动计算出；第二个公式为推导公式，即假设拖尾因子为1.0，即色谱峰完全对称时，用峰面积和峰高来表示半峰宽，因此两者是有区别的，当峰形拖尾或前沿严重时，两者差异将较大。5.色谱柱类型C18柱（ODS是其中的一种，主要区别是将未键合的OH基遮盖，而ODS是其商品名）、C8柱、氨基柱、苯基柱、阳（阴）离子交换色谱柱等，这些都是固定相表面键合的极性有机基团不同所至。不能混用。6.流动相常用溶剂的极性和截止波长由极性可以看出，在反相色谱中，要使出峰时间加快，可增加流动相中的乙腈比例，但要注意分离度的减小；若要使出峰时间减慢，可增加流动相中水的比例，增加水的比例还会引起分离度的增加；两者之间综合来考虑。举例说明。异丙醇转相时必须用；四氢呋喃使用时注意波长。必须选用色谱级的。梯度洗脱的注意事项：流动相、测定波长、预先混合的比例溶剂水甲醇乙醇异丙醇乙腈四氢呋喃极性常数1.000.950.880.820.650.57由于甲醇的极限波长为210nm左右，故短波长测定时，最好不要采用甲醇，而用乙腈。样品稀释用溶剂的选择：测定有关物质时最好选用流动相，避免以溶剂峰的干扰，水往往出倒峰。含量测定时，溶剂依情况而定，有时选用流动相费用太高，或是不易于操作。进样量最好选用定量环的量，以避免由于进样不准而引起的偏差。定量环可进行更换。溶剂水甲醇乙醇异丙醇乙腈四氢呋喃正己烷截止波长(nm)1702102102101902102107.检测器类型最通用的紫外检测器：注意测定波长较短时，基线有可能会飘；洗柱子时，尽量关闭光源，以延长使用寿命。二极管阵列检测器：目前使用者越来越多。用于多波长检测、峰纯度测定、对被测定物质进行紫外扫描后选择波长等用途。荧光检测器：灵敏度更高，对那些μg级的制剂品种，有时适用。但缺点是，基线稳定需平衡时间较长。示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器（电导检测器）等。8．定量分析8.1外标法：计算公式使用时应注意尽量保持样品溶液和对照品溶液浓度相同样品样品对照品对照品校正因子ACACf)(样品平均校正因子样品AfC)(8.2内标法使对照品溶液和样品溶液中内标物的浓度一致，否则计算将极为烦琐。该法仅是由于以前仪器的性能还不十分精确，进样体积还不能准确控制的很准时，才采用的。现在随着定量阀和自动进样器的使用，该法使用已越来越少，而且相反会引起不必要的误差，除非进样阀进样量不准时，应急采用。但该法在气相色谱中还是十分具有价值的。内标内标样品样品内标内标对照品对照品校正因子ACACACACf)(内标样品样品内标对照品对照品校正因子AACAACf)(8.3归一化法和自身对照法为有关物质（杂质）的测定方法。这是通过峰面积的比较来推算出各物质质量比例的方法。目前多采用自身对照法来进行。(1)归一化法：即一个峰的峰面积（杂质峰）占总峰面积或占主峰面积的多少。由于有关物质测定时，总峰面积的绝大部分均为主峰面积，故两者结果差不多，结果基本一致。。(2)自身对照法：通常是将供试品溶液稀释一定倍数后（通常为100倍）作为对照溶液（这里对照溶液与对照品溶液的区别需要强调一下），将其和供试品溶液分别进样测定，供试品溶液色谱图中的每个杂质峰面积，与对照溶液主成分峰面积进行比较或计算进行对杂质的判断。如比较，直接比峰面积大小，如计算，则采用公式计算杂质含量。%0.1%0.1自身对照主峰面积杂质峰面积AA这里，需要讲解的是：如果该物质线性关系良好，稀释100倍，峰面积还呈线性的话，那么，归一化法和自身对照法所得结果基本是一致的（最多差0.02%左右）。但如果稀释100倍，峰面积不呈线性的话，那么，归一化法和自身对照法所得结果将有所差异，如此时采用归一化法，将得不到较为正确的结果，因为此时，峰面积已不能较为准确地表示质量；而采用自身对照法，则可避免该情况的发生，这也是目前推荐采用该法的原因所在。但大家可以注意，目前你们测定的化合物，稀释100倍，通常，峰面积是呈线性的，原因是因为采用紫外检测器，一般化合物的线性范围可达1~106或107，但也有一些测定物质，线性范围较窄，此时便需要摸索其范围，但又不能单纯考虑线性范围，还应着重考虑供试品溶液的浓度才是最为重要的。9．流动相的调节为了得到较好的分离效果和柱效，有时要在流动相中加入一些少量的有机溶剂，如三乙胺来调节峰形变“瘦”；或加入缓冲盐，调节流动相的pH值或离子强度，以改变组分的保留时间达到分离效果等。这些物质称为“改性溶剂”。一般情况下，大家如要建立色谱条件，应先去查询文献资料，再进行适当的修改。前面提到的阳（阴）离子交换色谱柱，现多采用C18柱、流动相中加入表面活性剂以代替，但此时注意流动相平衡时间较长，最好小流速晚间过夜平衡后再进行试验，如何判定仪器平衡下面将介绍。pH值，一般色谱柱用2~8左右；目前一些新型色谱柱也可用于2~11的范围。