高效稳定纤维素菌群的筛选及其特性研究2

基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划课题（2012BAD14B10）、国家科技支撑技术（2009BAC53B06）和甘肃省农业科技创新项目—新型生态养猪关键技术开发、集成与示范。作者简介：王得武，甘肃白银人，在读硕士。E-mail：[e-mail]*通讯作者，博导，E-mail：[e-mail]高效稳定纤维素分解菌群的筛选及其特性研究王得武1，姚拓2，杨巧丽1，韩华雯2，张英2，卢虎2，滚双宝1*（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州730070；2.甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州730070）摘要：为获得能够在常温条件下（28~35℃）快速分解纤维素的微生物群体，以限制性培养技术从牛、鸡粪混合储粪池土样筛选了一组纤维素分解菌群，利用失重法测定了该菌群对不同纤维材料的分解能力，并采用固体平板技术对其菌株组成及其特性进行了研究。结果表明，筛选的纤维素菌群48h可将培养基内滤纸分解成糊状；6d对滤纸、玉米秸杆、稻草秸杆、小麦秸杆、柞木木屑和杨木木屑分解率分别为94.95％、48.52％、45.05％、44.30％、11.00％、1.22％；在发酵液初始pH5~11的范围内，对滤纸分解率超过84.59％，并将反应体系pH最终调节稳定在8.5~8.8；经分离纯化得到的8株真菌、6株细菌和3株放线菌相互接种构建的人工菌群不具备纤维素分解能力。纤维素分解菌群能够高效分解纤维素，对秸杆类木质纤维素也具有很强的分解能力。关键词：纤维素分解菌群；纤维素分解；木质纤维素；pH纤维素是地球上分布最广，含量最丰富的可再生资源，广泛存在于园林、秸秆、畜禽粪便等有机固体废弃物中[1,2]，当前这些资源利用率极低，在浪费能源的同时对环境造成了污染。利用微生物技术是实现这些废弃物资源化和解决环境问题的一种有效途径。目前应用和研究的纤维素分解菌多为单菌株，如工业生产纤维素酶的微生物菌种大多都是丝状真菌，然而单菌株往往存在纤维素酶系不健全、酶活不稳定、酶作用pH范围狭窄及产酶成本高等问题，对纤维素分解能力有限[3,4]。自然界中，纤维素在多种微生物共同作用下被分解从而进入地球的碳素循环，多种微生物的协同作用在纤维素分解过程中非常重要。因此，近年来微生物群体功能的研究越来越受到关注[2,5-8]。崔宗均等[2,5,6]利用限制性培养技术和优化组合方法，培养出了高温条件下具有很强活力的纤维素复合菌系，但在常温条件下受到一定的限制。本研究以畜禽粪便储粪池中土样为原材料，筛选出了一组在常温条件可高效降解纤维素的微生物群体，并对该菌群的木质纤维素分解能力、不同pH环境下的适应能力及其菌株组成进行了研究，以期为其进一步研究与推广应用提供理论依据与技术支持。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种来源森林腐殖质、腐烂的玉米秸杆、牛场料槽旁边土样、麦垛底部土样和牛鸡粪混合储粪中土样。1.1.2培养基蛋白胨5g，酵母膏5g，纤维素（新华滤纸）5g，NaCl5g，CaCO32g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.5mg，MnSO4·H2O0.16mg，ZnSO4·7H2O0.16mg，CoCl20.2mg，加蒸馏水至1000mL，pH7.0，121℃灭菌25min。1.1.3纤维材料滤纸以1%醋酸浸泡过夜后，用蒸馏水反复浸泡洗至中性，80℃烘干备用。秸杆和木屑粉碎过1mm筛，蒸馏水煮沸十分钟，以三层沙布过滤冲洗，80℃烘干恒重后备用。1.2纤维素分解菌群筛选取5g土样接入100mL培养基内培养，命名为第1代，待培养液中滤纸分解至不再明显变化，取菌液5mL接入新鲜培养基内，重复接种，接依次为2、3、4……n代。根据滤纸条的断裂程度判断降解效果：（+）滤纸边缘膨胀；（++）为滤纸边缘不定形；（+++）滤纸整体不定形；（++++）滤纸成团糊状；（+++++）滤纸完全成糊状。培养过程中，淘汰分解能力不稳定及分解能力退化的菌群。培养条件：28~35℃，80r/min微震。1.3纤维素分解菌群对不同纤维材料分解能力测定分别以0.5g的滤纸、玉米秸杆、稻草秸杆、小麦秸杆、柞木木屑和杨木木屑为培养基唯一碳源制作100mL培养基，接种5mL纤维素分解菌群，培养条件同1.2，6d后测定不同纤维材料的分解量（失重量），计算分解率（失重率），具体方法如下：参考测定饲料粗纤维使用的尼龙袋技术[9]及测定土壤纤维分解强度使用的尼龙网袋法[10]，利用38μm尼龙袋过滤培养基，再用蒸馏水冲洗，烘干，称量，恒重，计算。纤维材料分解率＝（纤维材料原质量+尼龙袋质量－烘干后纤维材料与尼龙袋质量和）/纤维材料原质量×100%。1.4纤维素分解菌群对不同初始pH值培养基pH的影响及滤纸分解能力测定以滤纸为培养基唯一碳源制作100mL培养基，将培养基初始pH值调至5、6、7、8、9、10、11，分别接种5mL纤维素分解菌群，培养条件同1.2，每隔12h测定培养基pH值，并观察培养基滤纸崩溃的情况，待培养基pH值稳定后测定滤纸分解量，计算分解率，测定方法同1.3。1.5纤维素分解菌群单菌株分离及单菌组合后对滤纸分解能力测定培养基加入1.5%的琼脂制作固体培养基，取纤维素分解菌群用生理盐水稀释至10-5、10-6、10-7分别涂平板。将涂好的平板放入32℃培养箱内培养3d，培养好氧菌；将涂好的平板装入厌氧袋，真空抽气1min，再充氮气1min，反复操作3次，将厌氧袋封口，置于32℃培养箱内5d培养兼性厌氧菌。根据平板培养基上菌落形态差异，多次划线分离直至纯化为单菌，对分离的单菌株相互组合接入以滤纸为唯一碳源的培养基，培养6d测定滤纸的分解率，测定方法同1.3。1.6数据分析采用MicrosoftExcel2003软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS11.5统计分析软件对数据进行统计分析.2结果与分析2.1纤维素分解菌群的筛选由表1可以看出，以森林腐殖质、腐烂的玉米秸杆、牛场料槽旁边土样、麦垛底部土样作为原材料，传代过程中培养基中滤纸有变软、边缘崩溃迹象，但始终不能彻底分解滤纸，至第10代，淘汰以上述材料筛选的菌群。从牛、鸡粪混合储粪池中的土样筛选的菌群，第1代培养基中滤纸240h完全崩溃，第2代培养基中滤纸120h完全崩溃，第3代培养基中滤纸72h完全崩溃，从第6代以后，滤纸崩溃时间逐步稳定到第48h左右，经过30代培养，获得了一组高效、稳定的纤维素分解菌群（图1）。表1不同材料所筛菌群对滤纸的分解效果Table1Filterpaperdecompositionofisolatedmicrobialcommunityfromdifferentmaterials菌种来源Strainssource第1代Generation1第5代Generation5第9代Generation9降解效果Degradationeffect时间Time（h）降解效果Degradationeffect时间Time（h）降解效果Degradationeffect时间Time（h）牛鸡粪混合储粪池cattleandchickenfecescompost+++++240+++++50+++++48原始森林腐殖质Primevalforesthumus+++240+++120+++120腐烂的玉米秸杆Rottencornstraw++240++120++120牛场料槽旁边Thesideoftroughatcattlefarm++240+++120+++120麦垛底部Thebottomofwheat-rick++240+++120++1200501001502002503001357911131517192123252729培养代数culturetimes（n）时间Time（h）图1不同代纤维素菌群对滤纸的分解效果Fig.1Effectsofdifferentculturetimesonfilterpaperdecompositionincellulosemicrobialcommunity注：图中标注时间为滤纸崩溃成糊状所需时间。Note:Themarkedtimeinfigurewerethedegradationtimeoffilterpaperintopastecompletely.2.2纤维素分解菌群对不同纤维材料分解力分解率与绝对分解量是反映菌群分解潜力的重要指标。纤维材料不同，分解强度差异较大，纤维素分解菌群6d分解滤纸0.47g，分解率达94.95%，显著高于其它纤维材料的分解量及分解率，对秸杆的分解能力居中，6d分解率为45%左右，对柞木木屑和杨木木屑分解率则较低，6d分解率分别为11.00%和1.22%（表2）。可见纤维素分解菌群对纯纤维素材料有分解能力极高，对秸杆类木质纤维素材料也有较高的分解能力，而对木材类木质纤维原料分解能力较差。表2纤维素菌群对滤纸、秆秸、木屑的分解能力Table2Degradationactivityoffilterpaper,straw,andsawdustbycellulosecompositemicrobialstrains材料Material分解量Decompositionvalue（g）分解率Degradationratio（%）滤纸Filterpaper0.47±0.009a94.95±1.67a玉米秸杆Cornstraw0.24±0.005b48.52±1.06b稻草秸杆Ricestraw0.23±0.004c45.05±0.76c小麦秸杆Wheatstraw0.22±0.005c44.30±1.08c柞木木屑Xylosma0.06±0.007d11.00±2.21d白杨木屑Poplarwoodchips0.01±0.005e1.22±0.93e注：表中不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），下同。Note：Differentlowercasesinthetablemeansignificantdifferenceat0.05level,Thesamebelow.2.3纤维素分解菌群对不同初始pH值培养基pH的影响及滤纸分解能力分别对pH5~11的培养基接种后，第24h培养液的pH集中到8左右，之后的72h内pH值在7.5~9.2范围内轻微波动，最终稳定在8.5~8.8之间（图2）。说明纤维素分解菌群在初始pH为5~11的条件下适应能力极强，并能够快速调节并稳定反应体系pH值。456789101112024364860728496108120培养时间Incubationtime（h）初始pH值InitialpHvalue567891011图2不同初始pH值条件下pH值变化曲线Fig.2pHchangeswithincubationtimeindifferentinitialpHvalues表3不同初始pH值条件下对滤纸分解Table3DecreaseoffilterpaperindifferentinitialpHvalue初始pH值InitialpHvalue崩溃时间Crashedtime（h）分解量Decompositionvalue（g）分解率Degradationratio（%）51080.42±0.006a84.59±1.15a6720.47±0.007c93.92±1.36c7480.47±0.008c94.68±1.47c8480.48±0.007c95.26±1.37c9480.48±0.006c94.99±1.20c10480.47±0.014c94.37±2.66c11720.45±0.010b90.15±1.91b由表3可以看出，滤纸分解率与滤纸崩溃时间变化较为一致，滤纸崩溃所需时间越短，测得的分解率越高。在初始pH为7~10的条件下滤纸48h即被分解为糊状，6d分解0.47~0.48g，分解率达94.37~95.26%，说明纤维素分解菌群最适pH为7~10，在该条件下菌群对纤维素分解能力极强。在初始pH为5、10、11的条件下，反应体系pH值能够迅速调节至正常范围内，但滤纸崩溃时间明