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高级生化复习重点及时间安排一、生化复习中常见名词总结：peptideunitmotifproteindenatureproteinquaternarystructure结构域蛋白质等电点α-螺旋蛋白质三级结构肽键核小体碱基互补核糖体核酶核酸分子杂交RNAi：在多种生物细胞中，外源或内源性双链RNA(dsRNA)可触发细胞内同源mRNA的特异性降解，从而使该基因表达沉默，这种现象称为RNA干扰（RNAi）。restrictionendonucleasevectorDNAcloning同源重组cDNA文库基因组DNA文库蛋白质印迹技术探针（probe）人类基因组计划后基因组研究geneknockout限制性片段长度多态性分析（RFLP）DNA芯片基本的（组成性）基因表达操纵子增强子管家基因Promoter二、生化复习中常见问答题总结：1．蛋白质的基本组成单位是什么？其结构特征是什么？答：实验证明氨基酸是蛋白质的基本组成单位。氨基酸的一般结构特征：已发现的氨基酸很多，但组成蛋白质分子的氨基酸只有20种左右。这20种氨基酸中，除脯氨酸外（是一种亚氨基酸），均为α-氨基酸。各种蛋白质所含的氨基酸的数目和种类都各不相同。α-氨基酸的结构，可用下式表示。式中Ｒ为α-氨基酸的侧链，方框内的基团为各种氨基酸的共同结构。从结构通式可以看出，除Ｒ为氢原子（即甘氨酸）外，所有α-氨基酸分子中的α-碳原子都为不对称碳原子。因此，第一，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示；第二，每一种氨基酸都有Ｄ-型和Ｌ-型两种立体异构体，这取决于α-碳原子上氨基的位置。书写时将羧基写在α-碳原子的上端，则氨基在左边的为Ｌ-型，氨基在右边的是Ｄ-型，这是与甘油醛的构型相比较后确定的。氨基酸的构型与旋光方向无直接对应的关系。从蛋白质水解得到的α-氨基酸（除甘氨酸外）都属于Ｌ-型的，所以习惯上书写氨基酸都不标明构型和旋光方向。虽然蛋白质组成成分中没有Ｄ-型氨基酸，但在生物界存在着Ｄ-型氨基酸，如某些细菌产生的抗生素就含有Ｄ-型氨基酸。2．何谓肽键和肽链及蛋白质的一级结构？答：3．什么是蛋白质的二级结构？它主要有哪几种？各有何结构特征？4．举列说明蛋白质的四级结构。5．举列说明蛋白质一级结构、空间构象与功能之间的关系。6．测定蛋白质空间构象的主要方法是什么？其基本原理是什么？7．细胞内有哪几类主要的RNA？其主要功能是什么？8．简述DNA双螺旋结构模式的要点及其与DNA生物学功能的关系。9．简述RNA与DNA的主要不同点。10．简述真核生物mRNA的结构特点。11．简述核酶的定义及其在医学发展中的意义。12．简述基因表达调控的意义。13．简述原核基因表达调控的特点。14．简述真核基因转录因子分类及功能。15．遗传信息是如何从DNA传递到蛋白质的。16．简述基因位点特异的重组和同源重组的差别。17．何谓基因克隆？简述基因克隆的基本过程。18．请简述基因工程的基本操作步骤。19．简述PCR的基本反应步骤。20．什么是癌基因，癌基因活化的机制？答：存在于生物正常细胞基因组中的癌基因称为原癌基因或细胞癌基因。在正常情况下这些基因处于静止或低表达的状态，不仅对细胞无害，而且对维持细胞正常功能具有重要作用；当其受到致癌因素作用被活化并发生异常时，则可导致细胞癌变，成为癌基因。癌基因活化的机制：（1）获得启动子与增强子：当逆转录病毒感染细胞后，病毒基因组所携带的长末端重复序列（LTR内含较强的启动子和增强子）插人到细胞原癌基因附近或内部，可以启动下游邻近基因的转录和影响附近结构基因的转录水平。从而使原癌基因过度表达或由不表达变为表达，导致细胞发生癌变。（2）基因易位：在染色体易位的过程中发生了某些基因的易位（translocation）和重排，使原来无活性的原癌基因移至某些强的启动基因或增强子附近而被活化，因而原癌基因表达增强，导致肿瘤的发生。（3）原癌基因扩增：原癌基因扩增（amplification）是原癌基因数量的增加或表达活性的增强，产生过量的表达蛋白也会导致肿瘤的发生。（4）点突变：原癌基因在射线或化学致癌剂作用下，可能发生单个碱基的替换--点突变（pointmutation），从而改变了表达蛋白的氨基酸组成，造成蛋白质结构的变异。不同的癌基因在不同的情况下可通过不同的途径被激活，其结果可以是：①出现新的表达产物，即原来不表达的基因开始表达，或不该在这个时期表达的基因进行表达；②出现过量的正常表达产物；③出现异常、截短的表达产物。以上异常情况，在肿瘤细胞中可以出现一种或二种以上的组合。21．阐述原癌基因产物与功能。答：将癌基因表达产物按其在细胞信号传递系统中的作用分成以下四类。（1）细胞外生长因子：生长因子作用于细胞膜上的受体系统或直接被传递至细胞内，再通过多种蛋白激酶活化，对转录因子进化磷酸化修饰，引发一系列基因的转录激活。目前已知与恶性肿瘤发生有关的生长因子有：PDGF、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子-2（TGF-2）、成纤维细胞生长因子（FGF）、类胰岛素生长因子I（IGFI）等。这些因子的过度表达，势必连续不断作用于相应的受体细胞，造成大量生长信号的持续输人，从而使细胞增殖失控。（2）跨膜的生长因子受体：另一类原癌基因的产物为跨膜受体，它能接受细胞外的生长信号并将其传人胞内。跨膜生长因子受体有胞质结构区域，并具有酪氨酸特异的蛋白激酶活性。许多原癌基因的产物同样具有该酶活性，例如c-src、c-abl等。另一些癌基因（c-mos和raf）所编码的激酶不是在酪氨酸上磷酸化，而是使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化。通过这种磷酸化作用，使其结构发生改变，增加激酶对底物的活性，加速生长信号在胞内的传递。（3）细胞内信号传导体：生长信号到达胞内后，借助一系列胞内信息传递体系，将接受到的生长信号由胞内传至核内，促进细胞生长。这些传递体系成员多数是原癌基因的产物，或者通过这些基因产物的作用影响第二信使[cAMP、甘油二酯（DG）、Ca2+、cGMP等]作为胞内信息传递体的癌基因产物包括：非受体酪氨酸激酶（c-src、c-abl等）、丝氨酸／苏氨酸激酶（c-ras、c-mas），ras蛋白（H-ras、K-ras、和N-ras等）及磷脂酶（crk产物）。（4）核内转录因子：已知某些癌基因表达蛋白（如myc、fos等）定位于细胞核内，它们能与靶基因的调控元件结合直接调节转录活性起转录因子作用。这些蛋白通常在细胞受到生长因子刺激时迅速表达，促进细胞的生长与分裂过程。目前普遍认为，c-fos是一种即刻早期反应（立早）基因（immediate-earlygene，IEG）。在生长因子、佛波酯、神经递质等作用下，c-fos能即刻、短暂表达，作为传递信息的第三信使。22．什么是抑癌基因?举例说明抑癌基因的作用机制。答：抑癌基因是一类抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。对于正常细胞，调控生长的基因（如原癌基因等）和调控抑制生长的基因（如抑癌基因等）的协调表达是调节控制细胞生长的重要分子机制之一。这两类基因相互制约，维持正负调节信号的相对稳定。当细胞生长到一定程度时，会自动产生反馈抑制，这时抑制性基因高表达，调控生长的基因则不表达或低表达。前已述及，癌基因激活与过量表达与肿瘤的形成有关。同时，抑癌基因的丢失或失活也可能导致肿瘤发生。例如人类P53基因：野生到P53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖中起着重要作用，因而被冠以基因卫士称号。P53基因时刻监控着基因的完整性，一旦细胞DNA遭到损害，P53蛋白与基因的DNA相应部位结合，起特殊转录因子作用，活化P21基因转录，使细胞停滞于G1期；抑制解链酶活性；并与复制因子A（replicationfactorA）相互作用参与DNA的复制与修复；如果修复失败，p53蛋白即启动程序性死亡过程诱导细胞自杀，阻止有癌变倾向突变细胞的生成，从而防止细胞恶变。当P53发生突变后，由于空间构象改变影响到转录活化功能及P53蛋白的磷酸化过程，这不单失去野生型P53抑制肿瘤增殖的作用，而且突变本身又使该基因具备癌基因功能。突变的P53蛋白与野生型P53蛋白相结合，形成的这种寡聚蛋白不能结合DNA，使得一些癌变基因转录失控导致肿瘤发生。23．什么是生长因子？阐述生长因子的作用方式及机制。答：（1）生长因子指在组织培养中，除了氨基酸、维生素、葡萄糖以及无机盐等正常成分之外，其可以代替培养基血清高分子物质的而促进细胞生长的物质。（2）作用方式及机制：生长因子由不同的细胞合成后分泌，作用于靶细胞上的相应受体，这些受体有的是位于细胞膜上，有的是位于细胞内部。位于膜表面的受体是跨膜的受体蛋白，包含具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。当生长因子与这类受体结合后，受体所包含的酪氨酸激酶被活化，使胞内的相关蛋白质直接被磷酸化。另一些膜上的受体则通过胞内信息传递体系，产生相应的第二信使，后者使蛋白激酶活化，活化的蛋白激酶同样可使胞内相关蛋白质磷酸化。这些被磷酸化的蛋白质再活化核内的转录因子，引发基因转录，达到调节生长与分化的作用。另一类生长因子受体是定位于胞液。当生长因子与胞内相应的受体结合后，形成生长因子-受体复合物，后者亦可进人胞核活化相关基因促进细胞生长。许多癌基因表达产物有的属于生长因子或生长因子受体；有的属于胞内信息传递体抑或核内转录因子。发生突变的原癌基因可能生成上述产物的变异体，后者的生成及过量表达导致细胞生长、增殖失控，引起病变。24．RNAi的作用机制答：RNAi最主要的作用是一小段的双链RNA分子（double-straindedRNA,dsRNA）它介导细胞内序列特异性基因表达阻断或封闭，也就是转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）,从而起到控制细胞的各种高级生命活动。（1）RNAi的作用水平：RNAi是在多重水平上发挥作用的。最先在华丽新小杆线虫中发现，dsRNA所诱导的基因沉默在转录后水平，因为dsRNA导致了相应RNA（mRNA）的降解，而基因启动子和内含子序列作为基因沉默触发物则无效。后来在植物中也发现，RNAi引起的基因沉默也是在转录后水平。除此转录后水平降解mRNA的机制外，RNAi还通过其他机制来影响基因表达。在植物中，dsRNA导致基因组中与沉默触发物同源序列的甲基化；如果与沉默触发物与启动子序列相同，则引起转录水平的基因沉默。而另外的研究还发现，在华丽新小杆线虫中，RNAi装置中，内源性编码的诱导剂，是在蛋白质合成水平发挥作用的。（2）RNAi的作用的基本过程：第一步：起始步沉默触发物被裂解，产生小干扰性RNA（smallinterferingRNAs，siRNAs）。第二步：效应步siRNAs与多种亚单位形成复合物—RNA诱导的沉默复合物（RISC），然后以RISC的方式降解单链的靶mRNA。第三步：沉默效应的放大和扩散。在华丽新小杆线虫、植物中，RNAi能够扩散到整个虫体，即使只有少量的触发物dsRNA。25．小干扰RNA和微RNA的区别：答：相同点：均由Dicer酶切割；长度22左右个碱基；都与RISC形成复合物（RNA诱导的沉默复合体）；与mRNA作用引起降解。不同点：SiRNA为内源或外源，长双链，RNA诱导产生，降解mRNA，完全互补，抑制转座子活性和病毒感染；miRNA为内源，发夹结构转录产物，且为单链；阻遏mRNA翻译，不需要完全互补，主要是发育过程的调节。26．结合自己的研究方向，RNAi技术有哪方面的应用。答：在多种生物细胞中，外源或内源性双链RNA(dsRNA)可触发细胞内同源mRNA的特异性降解，从而使该基因表达沉默，这种现象称为RNA干扰（RNAi）。由于RNAi在动植物抵抗外源病毒、生长发育调控方面起着重要作用，而且在功能基因组研究、基因治疗方面有着广泛的应用前景。（1）RNAi在基因治疗研究中应用看好。RNAi抑制内源基因的作用，为癌症的治疗提供了一个新的工具。（2）利用RNAi技术可快速发现药