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细胞工程编稿：李文强责编：苏晨辉章节概述植物细胞工程是建立在对细胞结构、功能、生理等研究基础上的新技术，在必修模块《分子与细胞》中，学生已学过动植物细胞的结构和功能、细胞的分化和全能性；在必修模块《遗传和进化》中，学生已学过生物变异在育种上的应用；在必修模块《稳态与环境》中，学生学习过人体内环境及免疫的知识，而这些都是学习本专题的知识基础。动物体细胞核移植技术及克隆动物既是动物细胞工程的重要内容，又是近几年来的热点问题，要做到在原有基础上的提高。目标认知学习目标1．简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。2．列举植物细胞工程和动物细胞工程的实际应用。3．举例说出动物细胞融合与单克隆抗体的原理和应用。重点1．植物组织培养的原理和过程。2．植物体细胞杂交的原理。3．用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。4．单克隆抗体的制备和应用。难点1．植物组织培养的实验。2．用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。3．单克隆抗体的制备过程。知识精讲重点知识讲解植物组织培养（1）培养基成分主要内容作用水水（H2O）为细胞代谢提供条件，参与细胞代谢无机盐大量元素：N、P、S、K、Ca、Mg。微量元素：Fe、Mn、Mo、B、Cu、Zn满足植物对各矿质元素的需求，参与各种物质合成、代谢调节，生长必需碳源蔗糖重要营养成分：愈伤组织不光合，利用蔗糖异养生活大气CO2重要碳源：完成组织分化，形成营养器官后，叶片能进行光合自养氮源NH4+、NO3—合成核酸、蛋白质、辅酶、核苷酸等生长因子细胞分裂素、生长素必不可少的调节物质：诱导脱分化形成愈伤组织，诱导愈伤组织再分化成植株维生素明显促进离体组织的生长状态固体培养基或半固体培养基形成植物地上、地下部分，利于生长培养要求无菌操作条件常温培养光照条件更换培养基细菌繁殖速度快，会产生污染植物细胞在常温下生长正常满足愈伤组织，及植株的光照需求防止代谢废物积累，满足营养需求（2）过程：脱分化：高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程再分化：愈伤组织继续培养，重新分化成根或芽等器官的过程愈伤组织：排列疏松、无规则，高度液泡化的无定型状态的薄壁细胞植物体细胞杂交概念：（1）来自两个不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞（植物细胞融合）（2）把杂种细胞培育成植株（植物组织培养）过程：植物细胞工程的应用：（1）植物繁殖的新途径①微型繁殖技术，快速繁殖优良品种；②作物脱毒，利用分生区部分进行组织培养，获得脱毒苗；③生产人工种子。（2）①单倍体育种：通过花药离体培养获得单倍体植株，再经过染色体加倍形成稳定的遗传新品种。②突变体的利用：筛选出组织培养中产生的突变体，培育新品种。（3）通过组织培养技术培育植物细胞，获取细胞产物。如紫杉醇的工业生产。动物细胞培养概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜培养基中，让这些细胞生长和增殖。过程：条件：无菌、无毒的环境、适宜的温度和pH和气体环境（一定浓度的CO2）营养（碳源：葡萄糖；氮源：氨基酸；生长因子：维生素和动物血清；无机盐；水）应用：获得有价值的生物制品，作为基因工程的受体细胞，培养细胞用于生理、病理或药理实验。动物细胞融合灭活病毒的作用：凝集蛋白质，使膜分子重新排布。比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的异同：细胞工程植物体细胞杂交动物细胞融合基本原理细胞生物学和分子生物学的原理和方法，工程学手段改造细胞操作水平细胞整体水平、细胞器水平实质内容改变遗传物质、产生新的性状，获得细胞产品或个体技术手段植物细胞杂交、植物细胞融合植物组织培养动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体制备、胚胎移植、核移植理论基础植物细胞的全能性、膜的流动性膜的流动性、细胞增殖诱导手段物理：离心、振动、电激化学：聚乙二醇物理：电激化学：聚乙二醇生物：灭火病毒（灭火仙台病毒）诱导过程（1）去细胞壁：纤维素酶、果胶酶（2）原生质体融合获得杂种细胞（3）植物细胞培养获得植株或用于发酵（1）胰蛋白酶处理获得分散的单个动物细胞（2）诱导融合获得杂交细胞（3）动物细胞培养获得细胞产品应用白菜——甘蓝杂交植物单克隆抗体的制备（杂交瘤细胞）单克隆抗体概念：单个B淋巴细胞进行无性繁殖获得的细胞群，产生化学性质单一，物质特异性强的抗体基本原理：（1）一种淋巴细胞克隆只产生一种特异性抗体（2）细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持亲代双方的特性（3）杂交瘤细胞的筛选，体外培养大量增殖，获得所需抗体优点：项目分泌特点生产单克隆抗体杂交瘤细胞特异性强、灵敏度高产量高，易纯化分离常规抗体各淋巴B细胞特异性差、灵敏度低产量低，分离困难制备过程：杂种细胞的筛选：单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。唯有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。体细胞移植和克隆动物克隆羊多莉一Dolly的诞生过程经典例题透析1．（11江苏）下列有关植物组织培养的叙述，正确的是A．愈伤组织是一团有特定结构和功能的薄壁细胞B．二倍体植株的花粉经脱分化与再分化后得到稳定遗传的植株C．用人工薄膜将胚状体、愈伤组织等分别包装可制成人工种子D．植物耐盐突变体可通过添加适量NaCl的培养基培养筛选而获得考点定位：本题考查植物细胞培养。指点迷津：A、愈伤组织源自外植体的脱分化，其细胞无特定形态、结构和功能；花粉离体培养得到的只是单倍体植株，B项描述缺少了秋水仙素处理的环节。C、人工种子内包装的是胚状体，而非愈伤组织；D、既要筛选出耐盐突变体，必须在含一定盐分的培养基上选择。参考答案：D2．用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是A．都需用CO2培养箱B．都须用液体培养基C．都要在无菌条件下进行D．都可体现细胞的全能性考点定位：本题考查细胞工程的应用。指点迷津：动物细胞培养过程中需要CO2培养箱给细胞提供适宜的气体环境，需要液体培养基提供液体环境，植物组织培养中不需要CO2培养箱，一般用固体培养基。动物细胞培养获得的是细胞株或细胞系，没有获得新的个体，所以没有体现细胞全能性。参考答案：C3．在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列哪项条件是不需要的A．消毒灭菌B．适宜的温度C．充足的光照D．适宜的养料和激素考点定位：本题考查植物细胞全能性的条件。指点迷津：动植物组织（或细胞）培养都要无菌操作，足够的营养，适宜的温度条件，当然植物组织培养还需要生长素和细胞分裂素等植物激素。参考答案：C4．（11江苏）关于现代生物技术应用的叙述，错误的是A．蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质B．体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体C．植物组织培养技术可用于植物茎尖脱毒D．动物细胞培养技术可用于转基因动物的培育考点定位：考查现代生物技术的应用。指点迷津：蛋白质工程是通过对基因进行一定程度的改造，进而合成新的蛋白质，以合乎人们的需求；植物组培中，由于茎尖几乎不含或少含病毒，因此可以培育出无病毒植株；在转基因动物的培育过程中，可利用动物细胞培养技术，使获得外源基因的受体细胞增殖。B项中的体细胞杂交技术，目前仅限于植物体细胞杂交，由此获得杂种植株，动物个体的体细胞杂交暂时不能获得克隆动物。参考答案：B5．用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是A．将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋巴细胞B．用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞C．用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合D．筛选杂交瘤细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体考点定位：本题考查单克隆抗体的制备过程。指点迷津：用纤维素酶处理植物细胞，去掉细胞壁，而B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞的融合需要用物理方法融合、诱导剂或灭活的病毒。参考答案：B6．经诱导融合得到的融合细胞还需经过下列哪项措施才能得到杂种植株A．分离杂种细胞，直接接种便可获得B．筛选鉴定杂种细胞后，再经植物组织培养才能获得植株C．让杂种细胞自交获纯系植株D．杂种细胞经传代培养成植株考点定位：本题考查植物细胞杂交。指点迷津：所选的两类细胞，例如分别用A、B表示在融合剂的作用下得到的融合细胞可能有AB、AA、BB型，而AA、BB型融合细胞仅体现一个亲本的遗传性状，无实际意义，要得到AB型杂种植株，必须经过筛选鉴定把AB型杂种细胞选出来。然后通过组织培养才能获得杂种植株。当然还可引申出AA、BB型细胞与用秋水仙素处理使染色体加倍形成多倍体进行分析比较。参考答案：B7．植物组织培养的过程如下图所示。请分析回答：（1）愈伤组织是由离体的组织或器官通过A______过程获得的，B、C过程是通过细胞的______实现的。（2）胚状体根据其来源不同，可以分为“体细胞胚”和“花粉胚”①用花药离体培养可获得“花粉胚”，同种植物的花粉胚与体细胞胚在染色体数目上的主要区别是_____________________________________________②如果用_________处理二倍体植物的花粉胚，能获得可育的植株，该过程是_________育种中不可缺少的步骤。③在一定条件下培养离体细胞可以形成体细胞胚进而发育成完整植株，其根本原因是每个细胞都含有__________________，这一过程体现了__________________。考点定位：本题考查植物组织培养的相关知识。指点迷津：愈伤组织是由离体的组织或器官脱分化得到的，愈伤组织在含有适宜比例的生长素和细胞分裂素以及营养物质的培养基上能够再分化形成胚状体进而形成试管植株。花药离体培养获得的植株是单倍体植株，每个植株细胞中都含有发育成生物个体的全部基因信息，这一过程体现了细胞的全能性。参考答案：（1）脱分化分裂和分化（2）①花粉胚细胞中的染色体数目是体细胞胚的一半②秋水仙素单倍体③本物种的全套基因植物细胞的全能性