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1啤酒酵母蔗糖酶提取、分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验(必修、综合性大实验)指导教师：滕利荣、郑良玉、吕绍武、王智2正交试验法最适条件（温度、pH、离子浓度）3一、目的要求1、熟悉工作曲线的制作方法及使用注意事项；2、学习掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法；3、学习掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；4、学习酶蛋白分离提纯的原理；45、学习掌握酶的比活力测定及其计算方法；6、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件；7、学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法；8、学习掌握SDS-PAGE电泳原理和操作技术5二、实验对象啤酒酵母蔗糖酶蔗糖酶是一种古老的酶，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母、曲霉、青霉等霉菌和细菌中，工业上通常从酵母中制取；蔗糖酶在食品工业中，常用来转化蔗糖增加甜味，制造人造蜂蜜，还用来制造果糖和巧克力的软心糖等。6该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧；在细胞膜外细胞壁中的称之为膜外蔗糖酶(externalyeastinvertase),其活力占总酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白；在细胞膜内侧细胞质中的称之为膜内蔗糖酶(internalyeastinvertase)，含有少量的糖；7这两种酶组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，故本实验未区分膜内酶与膜外酶。名称MW亚基Km(底物为蔗糖)pI(等电点)最适pH最适温度膜外酶27万(22万)双26mM5.04.9(3.5～5.5)60℃膜内酶13.5万双25mM4.54.5(3.5～5.5)60℃8三、实验步骤及原理1、蔗糖酶的提取2、蔗糖酶的纯化3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响6、蔗糖酶酶促反应动力学研究7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量91、蔗糖酶的提取(细胞破壁)10基本特征：单细胞，椭圆形、圆形或柱形。酵母菌细胞壁具三层结构——外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，都是复杂的分枝状聚合物，其间夹有一层蛋白质分子。酵母菌11细胞破壁的方法（1）高速组织捣碎（2）玻璃匀浆器匀浆（3）超声波处理法（4）反复冻融法（5）化学处理法（6）溶胞作用(酶溶解法)（7）自溶法12（1）高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。（2）玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。13（3）超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常选用浓度为50-100毫克/毫升菌体，在30至60Hz频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。（4）反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。14（5）化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。（6）溶胞作用(酶溶解法)：用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。（7）自溶法（本实验）：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。15干酵母粉溶于蒸馏水乙酸钠乙酸乙酯35℃恒温搅拌40分钟35℃恒温过夜本实验采用自溶法进行破壁补加蒸馏水搅拌均匀，成糊状离心弃沉淀及脂层E1记录生产厂家和批号用硫酸纸封严（过夜）162、蔗糖酶的纯化（1）有机溶剂分级沉淀（2）透析（3）离子交换层析（4）凝胶层析17E1用稀HAC调pH乙醇分级(32%乙醇饱和度)Ι离心，取上清乙醇分级(47.5%乙醇饱和度)Ⅱ离心，取沉淀透析水§磷酸缓冲液过夜离心，取上清E2E2E3DEAE52离子交换层析E3E4Sephadex-G100凝胶层析18酶的蛋白属性两性电离蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。19大分子(胶体)分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。稳定的因素颗粒表面电荷水化膜20+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜酸碱酸碱++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉21（1）有机溶剂分级沉淀向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。乙醇、丙酮是最常用的沉淀溶剂。22有机溶剂分级沉淀操作条件的控制溶剂选择常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。温度使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。样品浓度的控制一般认为蛋白质的初始浓度为0.5%-2%为好，粘多糖则以1%-2%较合适。23（2）透析利用具有一定孔径的亲水膜，在常压下依靠小分子物质的扩散运动，将含有高分子和其他小分子的溶液与纯水或缓冲溶液分隔的一种方法.透析的动力是由膜两边的浓度梯度形成扩散压。其速度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。常用温度：4℃。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。24新透析袋可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净。使用时，一端用橡皮筋或透析袋夹扎紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留1/3-1/2的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。用于去除大分子溶液中的小分子物质，称为脱盐。用于去除大分子溶液中的溶剂，此称为浓缩。保存：0.05%-0.1%叠氮钠，1mMEDTA或50%甘油。25（3）离子交换层析离子交换层析基本原理：以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。26离子交换剂不溶性载体:惰性的高分子固定骨架功能基团:与载体共价结合的固定的活性基团平衡离子:与功能基团以离子键联结可移动的活性离子平衡离子决定树脂正负流动相：具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。常采用柱层析。洗脱方法：增加离子强度、改变pH值。固定相：带有大量电荷的离子交换剂。27阳离子交换树脂：带负电荷，与阳离子交换①强酸性树脂：主要是磺酸型树脂，功能基团为磺酸根及甲基磺酸根；②中酸性树脂：主要是磷酸型树脂，功能基团为磷酸根；③弱酸性树脂：主要是羧酸型树脂和酚型树脂，功能基分别为羧基和酚基。离子交换树脂种类28阴离子交换树脂：带正电荷，与阴离子交换①强碱性树脂：功能基团多为季胺-N+≡R3；有两种强碱性阴离子交换树脂，一种含三甲胺基称为纺织品碱Ⅰ型，另一种含二甲基-β-羟基-乙胺基团，称为强碱Ⅱ型。②中强碱性树脂：兼有以上两类活性基团。③弱碱性树脂：弱碱性阴离子交换树脂的活性基团是伯、仲、叔胺基，即-NH2，-NHR，-NR2，吡啶基等。29如何选择离子交换介质对pI=5的某酸性蛋白质，当蛋白质为阴离子时，在pH5.5-9.0的范围内应选阴离子交换剂；当蛋白质为阳离子时，在pH3.5-4.5的范围内应首选阳离子交换剂30树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类；特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高。离子交换纤维素（本实验）★DEAE52离子交换树脂，别名DEAE纤维素52。为已经泡胀的二乙氨基乙基纤维素，是弱阴离子交换剂。功能基团是-OCH2CH2N(C2H5)2属预膨胀树脂，可用于蛋白、多肽、核酸等。31适量水浸泡，漂洗，使之充分溶涨；数十倍的0.5mol/L氢氧化钠液反复浸泡0.5～1h，每次换液皆须用水洗至近中性；按交换的需要用平衡离子处理；最后以交换用缓冲液平衡备用。离子交换纤维素的预处理32离子交换分离的基本步骤---装柱-平衡-上样-洗柱-洗脱-再生33装柱：本实验使用DEAE52离子交换树脂。柱内的DEAE52离子交换树脂应非常均匀地分布，防止出现截面和气泡，床面要平整。用起始缓冲液洗柱，控制好流速（防止流干）；平衡：用5mmol/LpH6.0的磷酸起始缓冲液平衡过夜。上样：注意控制流速，使流出液的流出速度为1.5ml/min左右。洗柱：样品全部进入床面后，在柱面加入2cm的缓冲液，在储液瓶中加入5mmol/LpH6.0的磷酸缓冲液，连接紫外检测器、记录仪和收集器，打开截流阀，洗出未吸附的杂蛋白。洗柱体积控制在5个柱体积左右。洗脱：本实验用含0.15mol/LNaCl的5mmol/LpH6.0的磷酸缓冲液洗脱，控制流速为1.5ml/min，用小试管收集。DEAE52离子交换层析（本实验）34凝胶层析的定义：凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。凝胶层析（gelchromatography）：常出现多种名称如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。（4）凝胶层析法(gelfiltration)35凝胶层析的基本原理凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。36凝胶层析的应用范围：凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。凝胶层析的优点：凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响生物学活性等优点。目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。37凝胶层析的特点凝胶层析操作简便，所需设备简单；分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100％；分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响；应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围很宽，如SephadexG类为102～105d；Sepharose类为105～108d。38装柱：将玻璃柱固定垂直，装入脱气的蒸馏水（约为柱体积的1/3），边搅拌凝胶，边向柱内缓慢、连续、均匀地装入凝胶（打开柱底端的螺旋夹）不要中断，使胶粒均匀沉降，无凝胶分层、沟流和气泡现象。平衡：用脱气蒸馏水平衡凝胶柱，流速控制在1ml/min。上样：上样量控制在柱体积的2%-5%（不要冲坏柱床表面）；洗脱：在凝胶上面缓慢加入缓冲液，连接恒压洗脱瓶，开始洗脱。Sephadex-G100凝胶层析（本实验）393、蔗糖酶的活性测定40酶活力(enzymeactivity)酶催化某一反应的能力——VV——单位时间内单位体积中底物(substrate)的减少量或产物(product)的增加量41[P][t][t1]酶速度(veloci