电化学发光检测技术原理

ElecsysPrinciple电化学发光检测原理及要点解读标记免疫技术的发展电化学发光检测原理电化学发光的技术特点校准概念及溯源性校准报警分析常见数据报警分析试剂特性解读检测菜单介绍主要内容放免酶免荧光免疫化学发光电化学发光1960‘S1970~80‘S2000‘S1，抗体技术的革命，从使用多克隆抗体向使用单克隆抗体转变2，从手工操作向全自动分析仪的转变3，从液相放射免疫技术向均相和固相免疫分析技术的转变标记免疫技术的发展•缺点半衰期短，试剂货架期短标记物不稳定每次需做标准曲线反应时间长，不易自动化检测使用放射性核素，需要一定防护•优点–分子量小,免疫损耗小–简便、灵敏、特异–可自行设计试剂盒–应用范围广标记物:碘125标记免疫技术的发展－放射免疫测定法(RIA)底物:无需底物•优势–灵敏度较高–试剂稳定–较快的速度–无污染•缺点–包被表面积小（灵敏度和速度）–包被均一性不足（精密度）–检测技术多为颜色反应（特异性和灵敏度）–反应时间不一致,造成结果的偏差(特别在手工操作时)标记免疫技术的发展－酶联免疫测定法(ELISA)标记物:HRP辣根过氧化物酶/ALP碱性磷酸酶底物:TMB四甲基联苯胺/对硝基苯磷酸酯P-NPP•优势–灵敏度较高–成本较低–荧光检测信号–操作简便•缺点–传统的微板吸附包被技术–均一性差、重复性差–批量检测不能实现全自动–每次检测需要做定标曲线，浪费成本样本的前处理技术操作过程完全同ELISA方法标记免疫技术的发展－时间分辨荧光免疫(TRFIA)标记物：铕(Eu3+)、钐(Sm3+)等镧系元素底物:镧系元素螯合物•标记物：ALP碱性磷酸酶•底物：MUP（4甲基伞形酮酰磷酸）•激发物：光•最终检测信号：荧光强度•代表产品：–美国AbbottAXSYM–法国bioMérieuxVIDAS标记免疫技术的发展－酶荧光免疫测定法(MEIA)•标记物：HRP辣根过氧化物酶/ALP碱性磷酸酶•发光底物：鲁米洛、金刚烷•激发物：特定的化学环境•最终检测信号：可见光强度•代表产品：–美国J&JOrthoVitrosEci–美国BeckmanCoulterAccess,Dxi800标记免疫技术的发展－酶促化学发光免疫(CLIA)•标记物：吖啶酯,吖啶酯衍生物•发光底物：无需底物,标记物直接发光•激发物：特定的化学环境•最终检测信号：可见光强度•代表产品：–德国SIEMENSCentaurXP–美国AbbottI2000标记免疫技术的发展－直接化学发光(CLIA)•标记物：三联吡啶钌•发光底物：三丙胺•激发物：直流电场•最终检测信号：可见光强度•代表产品：–罗氏公司e411,E170,e601,e602标记免疫技术的发展－电化学发光(ECLIA)标记免疫技术的发展电化学发光检测原理电化学发光的技术特点校准概念及溯源性校准报警分析常见数据报警分析试剂特性解读检测菜单介绍主要内容电化学发光免疫检测原理-名称的由来ELECTRO电CHEMI化学LUMINESCENCE发光IMMUNO免疫ASSAY分析电化学发光免疫测定系统Elecsys®电化学发光链霉亲和素-生物素间接包被技术磁性微粒子固相载体检测系统电化学发光免疫检测原理-技术特点专利的电化学发光技术标记物：三联吡啶Ru(bpy)32+递电子体：三丙胺TPA反应启动方式:直流电场电化学发光免疫检测原理--电化学发光里程碑式的标记物：三联吡啶钌水溶性，分子量小结构稳定，免疫损伤小,易于标记应用广泛（激素，DNA等）与三丙胺(Tripropylamine,TPA)共同构成电化学发光系统三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2++NHS(N羟基琥珀酰胺酯)电化学发光免疫检测原理--标记物电极表面的电化学发光反应电化学发光免疫检测原理--电化学发光的反应过程发光标记物:三联吡啶钌Ru(bpy)32+三联吡啶钌“催化”三丙胺发出可见光反应产物:三丙胺自由基(TPA*)+620nm的光子发光底物:三丙胺(TPA)电化学发光启动条件:直流电场反应特点:迅速,可控,循环发光CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3CH2CH2CH3CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3失e-CH2CH2CH3CH3CH2CH2-N-C-CH2CH3CH2CH2CH3失H+CH3CH2CH2-N-HCH2CH2CH3+CH3CH2CHO.+..H氧化Ru(bpy)33+激发态Ru(bpy)32+基态Ru(bpy)32+还原电化学发光免疫检测原理—电化学发光的反应过程三丙胺阳离子三丙胺自由基三丙胺自由基-e-电极电极失e-+丙醛二丙胺独特的磁性微粒作为固相载体直径2.8um表面的凸凹使包被面积放大悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相,大大提高反应效能磁性微珠易于通过磁场磁性吸引和分离电化学发光免疫检测原理--固相载体显微镜下的磁微粒专利的链霉亲和素－生物素系统电化学发光免疫检测原理--链霉亲和素和生物素技术SA链霉亲和素StreptoavidinSABBBBB生物素BiotinB生物素BiotinB生物素BiotinB生物素Biotin+=适用于包被各种化合物，如多肽、脂多糖。SA均匀牢固地包被在磁性微粒上链霉亲和素----生物素包被技术Streptoavidin,SABiotin，BB衍生物结合的抗原或抗体与标本进行液相反应电化学发光免疫检测原理—链霉亲和素和生物素技术SA亲和素磁性颗粒抗体B抗体生物素B生物素SA亲和素磁性颗粒ECL检测原理ElectroChemiLuminescence(ECL)电化学发光技术结合Ruthenium结合磁珠转移至电极;标记后免疫复合物与游离组分分离施加电压启动化学发光反应信号检测eanalyzerperformanceECL检测原理免疫复合物的形成Source:RocheDiagnosticsResearchandDevelopment抗体Ruthenium生物素抗体抗原免疫复合物第一抗体标记生物素（与微磁珠结合）第二抗体标记Ruthenium（产生光信号）两种抗体皆能与靶抗原特异性结合电极电极工作电极磁铁光电倍增管TPATPATPATPA电化学发光免疫检测原理—测量室中的反应1.使用清洗液(CleanCell)清洁测量室2.移入磁铁,并使用TPA清洁测量室活化电极3.反应复合物随TPA一起吸入测量室,4.工作电极加电压,6.移开磁铁，TPA冲走所有反应物。磁微粒被吸附未结合到固相的游离标记物被冲走7.使用清洗液(Cleancell)清洁测量室。5.电极表面反应后发出光子,同时PMT检测光子信号测量室组成和结构电化学发光免疫检测原理—测量室的结构流动测量室可升降的磁性分离系统彻底的清洗系统高度自动化电化学发光免疫检测原理—分析类型夹心法竞争法桥联法电化学发光免疫检测原理—夹心法检测原理1.加入R1-生物素结合的抗体2.加入R2-[Ru(bpy)3]2+标记的的抗体3.加入待测样本，温育9min，形成双抗夹心复合物4.加入M-亲和素包被的磁微粒,温育9min，钌标记物通过待测样本和亲和素生物素连接到磁微粒上。5.反应复合物被吸入测量室进行磁性分离及其电化学发光测量。ReagentsipperReagent夹心法TPAECLFIRSTIMMUNOLOGICALREACTIONSECONDREACTIONLIGHTREACTIONSANDWICHPRINCIPLESERUMCONSTITUENTSCONCENTRATIONSIGNAL(LIGHT)MAGNETICFORCE&ELECTRICALPOTENTIALTPAANTIGENBIOTINYLATEDANTIBODYRUTHENIUMLABELLEDANTIBODYSTREPTAVIDIN-COATEDMICROPARTICLETRIPROPYLAMINE测定成正比：信号低=浓度低信号高=浓度高检测有多个结合位点的抗原如TSH，HCG，HBsAg，AFP等电化学发光免疫检测原理—夹心法检测原理测定大分子抗原电化学发光免疫检测原理—竞争法检测原理1.加入R1-[Ru(bpy)3]2+标记的抗体2.加入待测样本，温育9min，形成抗原抗体复合物。-3.加入R2-生物素标记的与样本同源的抗体。4.,加入M-亲和素包被的磁微粒；温育9min。未与待测抗原结合的钌标记物通过R2结合到磁微粒上5.反应复合物被吸入测量室进行磁性分离及其电化学发光测量。eagentsipperReagent竞争法测定成反比：信号低=浓度高信号高=浓度低TPAECLCONCENTRATIONSIGNAL(LIGHT)TPAANTIGENBIOTINYLATEDANTIGENRUTHENIUMLABELLEDANTIBODYSTREPTAVIDIN-COATEDMICROPARTICLETRIPROPYLAMINEFIRSTREACTIONSECONDREACTIONLIGHTREACTIONCOMPETITIVEPRINCIPLEMAGNETICFORCE&ELECTRICALPOTENTIAL检测仅一个结合位点的抗原等如FT3，E2，HBcAb等。测定小分子抗原电化学发光免疫检测原理—竞争法检测原理桥联法（BridgingPrinciple）电化学发光免疫检测原理—桥联法检测原理理论基础：单位IgG分子具有2个抗原结合位点二聚体分泌型IgA具有4个抗原结合位点五聚体IgM可有10个抗原结合位点检测相应的IgG和IgM抗体总量。如HBcAb测定成正比：信号低=浓度低信号高=浓度高双抗原夹心测定抗体标记免疫技术的发展电化学发光检测原理电化学发光的技术特点校准概念及溯源性校准报警分析常见数据报警分析试剂特性解读检测菜单介绍主要内容电化学发光免疫检测原理—发光及检测系统直流电场1.5v电压启动0.2-0.6秒达到发光峰值发光光子数可控迅速放大0.00050,000100,000150,000200,000250,000300,000350,0000.400.600.801.001.20Time[sec.]0.20030060090012001500ECLintensity(counts)appliedvoltage[mV]稳定的试剂电化学发光免疫检测原理—稳定的试剂mIU/ml372010.1和2014.9全球客户端FSH病人结果分布mIU/ml%美国FT4项目20个不同批号的的病人结果分布2010.1-2014.9全球客户端FSH中位值变化%pMol/l电化学发光免疫检测原理—优异的结果稳定性宽广的线性范围电化学发光免疫检测原理—线性范围光子数范围:0-10,000,000(1亿)超宽的线性范围及检测灵敏度电化学发光免疫检测原理—宽线性及灵敏度电化学发光免疫检测原理－简单的试剂管理多模块通用试剂E170,e411,e601,e602二维条形码自动输入全部信息试剂联体包成分独立稳定好无需配制，即开即用自动开闭试剂瓶盖，有效地防止挥发等标记免疫技术的发展电化学发光检测原理电化学发光的技术特点校准概念及溯源性校准报警分析常见数据报警分析试剂特性解读检测菜单介绍主要内容1.参考系统标准曲线ReferenceStandardCurve(Roche研发部)根据“WHO”的标准化要求使用10－12个点与试剂批号无关是制作主校准曲线（mastercalibrator）的基础电化学发光校准概念－校准传递2.主校准曲线MasterCalibrationCurve(Roche生产部)使用5或6个点(mastercalibrators)使用特定批号的试剂（一级试剂，masterreagent)总曲线的形状是用依照Rodbard功能的4个参数来描绘的主校准曲线数据被编码进了特定批号试剂的2维条形码靶值被编码进了校准试剂盒（CalSet）的条形码中电化学发光校准概念－校准传递3.客户端的校准测试2个校准品(CalSet1和CalSet2)校准品的测量结果按照数学方法的计算结合到与CalSet或试剂盒上的2