高分子翻译

22高分子基因载体的设计原理目录22.1前言22.2传统高分子聚合物22.2.1阳离子聚合物结构22.2.2可充电部分的类型22.2.3电荷密度和分子量的影响22.2.4降解性22.3混合动力或接枝聚合物的多功能性22.3.1隐形复合物的形成：聚乙二醇化22.3.2生物相容性问题22.3.3接枝或表面功能22.3.4阳离子一半的金属表面制片与DNA绑定22.3.5配体目标22.4聚合物纳米粒子或注射药性介导基因分送22.5结束语22.1前言质粒基础基因疗法在治疗某些人类临床试验有效或无效的疾病上是一个有前途的方法。在过去的十年里，在各种学科的领域里都有了仔细的研究和发展，例如，化学、分子学、生物学、制药学、生物化学、化学工程和医学，已经向设计优化和用更有效的方法将治疗性基因转移到细胞中发展，并最终运用到人类的临床设置上。到目前为止已有少数成功的临床试验被报道，其中涉及到病毒载体系统（逆转录病毒、腺病毒）被证明有效转导和高水平的基因表达。然而，临床安全和有效性仍旧被他们主要的缺点阻碍，例如固有的毒性，短期或长期的风险，比如代的宿主免疫反应和插入的基因致癌基因激活的可能性。就以上原因，病毒载体系统被认为是危险的病毒载体，曾经被介绍和测试潜在的更安全，更多基因传递和临床基因治疗的有效方法。病毒载体系统通常既不是由裸质粒DNA又不是各种各样的DNA络合剂组成，如阳离子脂质体和多顺反子性的聚合物。然而，目前可用合成病毒载体系统被很多问题困扰，例如效率低下，细胞毒性和水溶性等限制他们体内的许多可能应用程序使用的问题，因此，迄今为止很少有病毒载体成功的实验。本章的重点是检查短暂的关键元素，通常需要病毒基因传递领域的研究而不是审查所有聚合物基因传递载体。我们希望提供基本和最新的标准，应该在设计之前解决新型聚合物途中创建强大安全可靠的病毒载体系统。22.2传统的多顺反子性带电的聚合物22.2.1阳离子聚合物的结构许多种类的阳离子聚合物，即线性、树突、交联、支化和网状的聚合物，已经介绍和测试了它们在基因领域潜在的适用性。具有代表性的多顺反子聚合物的结构图如22.1所示。一些线性阳离子聚合物在第一阶段被发现是有前途的，但是，一些意想不到的特点如DNA复合物的水溶性，低水平的转染效率，细胞固有的毒性，这些都限制了它们作为体内基因携带者的使用。然而，多顺反子性的树枝状分子仍然很有吸引力，因为它们界限清楚的结构和易于控制表面功能设计的生物医学应用。聚酰胺和聚乙烯亚胺都测试了它们潜在的使用程序，这些都表现出相对较高的体外和体内转染效率。一个重要的特点就是聚酰胺和聚乙烯亚胺都是由三级含胺化合物骨干组成，具有识别PH敏感度的功能。所谓的“质子海绵效应”或“核内缓冲假说”机制一般是先进聚合物的转染效率高。除了核内缓冲功能。设计球状聚合物而不是线性或分支或灵活的结构的另一个优点，球状聚合物能降低细胞毒性。图22.1传统的聚阳离子聚合物结构（a）多聚赖氨酸（b）线性聚乙烯亚胺（c）支链聚乙烯亚胺（d）聚酰胺-胺型树枝状大分子4代22.2.2可充电部分的类型一种基于电荷类型复杂构成与聚阴离子DNA的基本要求是，聚合物包含阳离子的电荷性质。通常，可充电部分的类型主要是第二、第三和季铵衍生物。第三含胺聚合物在缩合质粒DNA情况下没有原先或含季胺聚合物的有效，因为它们在生理条件下具有较低程度的质子化。有趣的是，季胺与DNA的有效结合甚至比伯胺与DNA的的相互作用更强烈。然而，值得注意的是，季胺阳离子的转染效率非常低。质粒DNA缩合成纳米颗粒有助于理化性质和对酶的稳定性。在体外，聚阳离子微粒与DNA结合的转染效率会增加，是因为它们可以绑定到带负电荷的细胞膜。有时候，它们也可以通过沉积物理性的接触到细胞表面。然而，对于体内转染试验系统效率低下是因为配合物的净正电荷，另外大颗粒的形成也能显著降低复合物的mo-bllity.带电粒子与蛋白多糖是由一个核心蛋白和硫酸或羧基胺聚糖的相互作用的结合蛋白。因此，反式带正电荷的DNA复合物会被胞外多聚阴离子胺聚糖复合物的相互作用影响，从而抑制他们在组织内的流动性和在体内对某些特定细胞的目标性。最近，我们小组报告了另一个有关聚酰胺-胺树型高分子的传递系统。羟基聚酰胺-胺树型高分子与聚酰胺-胺树形高分子相比除了终端官能团是羟基而不是伯胺之外，其余结构相同。所以，羟基聚酰胺-胺树型高分子自身不能与DNA形成一种基于电荷的复合物，并显示出较低的转染效率。内部季胺通过甲基化而戴上电位，并把聚合物向转染主管转变来保护中性的DNA复合物潜在的电势电位。22.2.3电荷密度和分子量的影响在基因产地实验一般用的具有代表性的聚阳离子聚合物的物理化学性能列于表22.1。聚（L-赖氨酸）（PLL），作为聚阳离子聚合物的早期阶段的一个标准的基本聚合物介导的基因传递实验，具有多肽骨干和在终端伯胺的赖氨酸侧基端单元。由于其内体的缓冲部分不足，需要额外的高分子化合物氯喹来实现基因的表达。相对于电荷密度（每一个单体单元的分子量的阳离子电荷），PLL和PAMAM在电荷密度比PEI（0.0097锁相环；0.0087PAMAM，与0.0238的PEI）。就如表22.1展示的那样，PEI转染效率有比其他转染试剂更高，是因为它内涵体缓冲中与核靶向性，另外因为它的高电荷密度和不可降解性而显示出对细胞较高的毒性。因此，细胞毒性和转染效率被认为是分子量、电荷密度、降解率和聚合物结构的一种功能。图22.2（a）季铵化PAMAMG4固色剂的合成（b）PAMAMG4/DNA和QPAMAM-OH/DNA复合物的电位差（c）报告基因在检测中表达的电荷比表22.1具有代表性理化性质的聚阳离子聚合物一般用于基因传递实验MolecularOrderofCationicInvitroPolymerweight(kDa)amines(degree)charge/Monomer(þ/Da)aStructureDegradabilityInvitrotoxicitybtransfectionefficiencybPAMAMdendrimerG4141,30.0087Globular,dendrimerPoor,polypeptideþþþLinearPEI221,20.0238LinearNotdegradableþþþþþBranchedPEI251,2,30.0238Branched,Notdegradableþþþþþþ22.2.4降解性在细胞毒性视图和DNA的释放作为对特定的环境刺激下的响应，即，水解，酶消化，pH值的差异，和还原电位差，聚合物的降解功能是有效的聚合物基因载体的一个基本特征。可降解的化学键包括酯，氨基甲酸酯，二硫化物，原酸酯苷、缩醛、苷和相关的官能团。如图22.3所示，该策略是构建可降解的复合物，功能分区设计可以达到一个较低水平的聚合物介导毒性和高水平的基因表达，通过增加DNA从复合物中释放达到目标的复合物后，降解或不可降解的聚合物为基础的系统。我们和其他人设计的各种可降解的聚阳离子的聚阳离子的聚酯聚合物，有有自行组装形成纳米颗粒与质粒DNA体外显示基因的潜能。两个主要的合成方法的报道：(i)二醇和羧酸衍生物的缩合熔聚，(ii)使用二丙烯酸酯和胺基的缩聚的迈克尔加成。简短的聚合方案如图22.4所示。图22.4阳离子聚合物的合成(i)二醇和羧酸衍生物的缩合熔聚，(ii)使用二丙烯酸酯和胺基的缩聚的迈克尔加成。埃里克和琳恩等人报道了第一个方法去开发一个并行合成库和筛选方法，并提出氨基酸聚酯有效的转染效率。合成库是有140个结构不同的的聚合物构造而成。其中，只有一半的结构即70种是易溶于水的，这可以进一步的表征DNA的缩合和转染。此外，这70种结构中有56种可以与DNA形成配合物，而另外的14种不能。除了较低吞吐量的合成和表征方法，高通量操作法成功地制备了2350个结构不同的合成库，可降解的阳离子聚合物的液体处理自动化的援助。这提供了大量的结构功能信息。另一个可降解系统是对细胞膜内外还原电位差敏感的二硫键。基本的想法是，还原形式的谷胱甘肽是红细胞氧化形式浓度的500倍。二硫键聚合物可降解的原因是DNA从复合物中的释放减少。许多小组研究了氧化还原引发DNAS释放含有二硫键的聚合物载体，DNA复合物易被硫解，从而影响阳离子聚合物和络合DNA多价的相互作用，用以便DNA可以迁移到细胞质中。格瑟兰和他的同事为基因传递合成了可逆的交联复合物。他们用PEI聚合物与胺反应采同型双功能交联剂将二硫键引入复合物内。有些组还试图制备含半胱氨酸多肽来评估他们的复合物的形成和转染效率。尽管含有二硫键的聚合物显示出与DNA的络合增强，以及稳定性和可降解性增强，但真正的机制仍不清楚。一个可能的解释是还原形式的谷胱甘肽可能与复合物起反应，释放到细胞质中的DNA是受基因表达中细胞内组织的调控。最近，还提出另一种假设，曼德尔和他的同事在1993，25中提出的蛋白质二硫键异构酶（PDI），可能在生物大分子不能扩散通过细胞膜时硫解中发挥重要作用的。王和他的同事报告了新的可降解的阳离子聚合物含有磷酸骨架和带正电荷的部分。聚合物主链的制备是通过以三异丁基铝为引发剂诱发4-甲基-2-氧代-2羟基-1,3,2,-二氧四羟磷茂开环而成。此外，磷原子的修饰可能导致电子与质粒DNA相互作用中引入单个或多个阳离子电荷。尽管聚合物的转染效率较低，它仍需要一个额外的内涵体破坏剂，使之在体外实验中获得较高水平的基因表达，如氯喹，，生物相容性和更低的细胞毒性被认为是聚合物在体内应用前景中的主要特点。22.3混合或接枝聚合物的多功能性22.3.1隐形复合物的形成：聚乙二醇化最近的一个策略试图克服阳离子聚合物和亲水聚合物如PEG链接或共轭的问题。PEG具有许多有用的特性，如在水中的溶解度高，无免疫原性和改进的生物相容性。PEG已广泛用于许多水溶性小分子和蛋白质药物，此外，PEG是经常被用来作为靶向配体和聚合物载体之间的间隔，为了制备离子合成基因载体，PEG也被耦合到许多聚阳离子聚合物，如聚（L-赖氨酸），树枝状聚合物，polyspermine，和聚乙烯亚胺。因此，共轭PEG帮助反应物提高在血液中的半衰期，增加的溶解度，并减少对配合物与DNA的免疫反应。此外，受体介导的内吞作用可以通过引入特定的靶向配体在PEG结束之前的实现。PEG链作为配体和受体之间的柔性间隔，PEG共轭共聚物和DNA形成涂覆PEG聚离子复合物的机制如图22.5所示。22.3.2生物相容性问题聚合物基因载体生物学评价应该确定接触聚合物本身或在细胞和身体部分降解后的组成材料造成的潜在毒性。有三个由FDA提出的主要考虑因素，这也被认为是适用于聚合物基因载体材料。首先，该聚合物或聚合物降解后释放的成分应该不会造成任何不利的局部或全身的影响。第二，他们不应该致癌。最后，他们不应该产对生殖和发育不良的影响。此外，聚合物的生物和化学特性和性质，程度，频率，和他们对局部细胞或身体暴露持续时间必须考虑。因此，任何新的用于临床的聚合物使用前都应根据系统测试的充分的数据进行谨慎的评估以确保聚合物在体内使用的安全。用亲水性聚合物如聚乙二醇修饰聚合物，是一种改善聚合物的生物相容性的方式，这是据报道，减少蛋白如纤维蛋白，白蛋白，或凝血酶的表面吸附。