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1高压氧使干细胞释放STEMCELLMOBILIZATIONBYHYPERBARICOXYGEN翻译郑成刚审校刘青乐尤景春*StephenR.Thom,VeenaM.Bhopale,OmaidaC.Velazquez,LeeJ.Goldstein,LynneH.Thom,DonaldG.BuerkInstituteforEnvironmentalMedicine,DepartmentofEmergencyMedicine,SurgeryandPhysiology,UniversityofPennsylvaniaMedicalCenter,Philadelphia,Pennsylvania19104-6068摘要：我们设想高压氧暴露会通过NO依赖的途径使骨髓中干/祖细胞动员。一次2ATA的HBO暴露2小时，外周血中CD34+细胞总数增加一倍。20次HBO暴露后，尽管外周血白细胞总数没有显著升高，但CD34+细胞数量增加8倍。每100，000单核细胞中克隆形成细胞（CFCs）数从16士2上升到26士3。增加的CFCs都是CD34+亚群，但只在治疗后立即采集的标本中出现细胞增加。后裔细胞的血管内皮生长因子-2受体和基质来源生长因子受体高比例表达。在小鼠试验中，高压氧使外周血干细胞因子上升50％，表达干细胞抗原-1和CD34的细胞升高3.4倍，克隆形成细胞升高1倍。高压氧暴露后骨髓中NO浓度上升1008士255nM。内皮NO合成酶基因敲除的小鼠高压氧暴露后没有观察到干细胞的动员。另外，治疗前使用NO合成酶抑制剂的野生型小鼠，经HBO暴露后干细胞因子和循环干细胞数量没有变化。我们得出结论，HBO是通过刺激NO合成使干/祖细胞动员的。---------------------------------------------------------------------------------------------------------第二军医大学高压氧医学中心，上海，200433*武汉同济大学医学院康复科2前言：这项研究的目的是确定人类和动物经高压氧暴露是否能使骨髓中的造血干/祖细胞动员。来自于成人的多能干/祖细胞显示出与胚胎干/祖细胞相似的特性，并期望能治疗退行性和遗传性疾病。出生后，新生血管是通过先前存在的血管内皮的萌芽和由于缺血致血管再生过程中，骨髓动员的内皮干/祖细胞形成的。外周缺血、剧烈运动、化疗以及造血生长因子都可以增加骨髓干/祖细胞的动员。干/祖细胞可以直接由骨髓采集并经体外处理而获得。为了进行骨髓移植，主要是通过使用化疗药物和生长因子获得造血干/祖细胞。已经设想利用这些方法来获得自体同源干/祖细胞，治疗诸如器官和肢体缺血、顽固性创面等疾病，但由于存在急性动脉栓塞、心绞痛、脓毒血症和死亡的危险，实际应用仍停滞不前。NO在通过动员干细胞激活因子、cKit配体，触发干/祖细胞从骨髓释放中起关键性作用。高压氧可以在不同组织中激活NO合成酶，于是我们设想暴露于高压氧可以刺激干/祖细胞释放到周围循环中。在鼠类动物模型中，我们发现高压氧能促进干/祖细胞动员、并将其吸引到缺血创面，促进缺血创面的愈合。干/祖细胞在需血管生长的缺血性创面的修复中有非常重要的意义。高压氧用于治疗多种疾病，在高压氧舱里病人吸入的纯氧其氧分压可达3.0ATA。对术前放疗的患者，高压氧已经成为减少放射性骨坏死发病率的预防性治疗的常规方法。我们取正常健康志愿者和术前进行预防性高压氧治疗以减少放射性骨坏死患者的外周血标本，观察了血中干/祖细胞的数量。随后观察了小鼠干/祖细胞动员的机制。由此证明，高压氧可通过.NO依赖机制，引起人类和小鼠干/3祖细胞的快速动员。方法高压氧对人类干细胞动员的影响：这方案已被社会公共伦理委员会（InstitutionalReviewBoard）和Abramson癌症中心临床试验科学监督委员会(ClinicalTrialsScientificMonitoringCommitteeoftheAbramsonCancerCenter)批准。患者来自宾夕法尼亚大学环境医学院（UniversityofPennsylvaniaInstituteforEnvironmentalMedicine），为预防放射性骨坏死接受预防性高压氧治疗的病人。经患者同意，在第1次、第10次、第20次高压氧（2.0ATA，2h）治疗前后采血。所有患者都是因为头、颈部肿瘤接受放疗的病人，无开放性溃疡创面，没有使用皮质类固醇激素和化疗药物。根据目前标准治疗方案，为预防放疗产生的口腔干燥症和骨溃疡，患者在口腔手术之前接受高压氧治疗。男性18例，平均年龄56士2岁；女性8例，平均年龄53士4岁。3名男性舱内护理人员为高气压暴露对照，平均年龄48士3岁，不吸氧，只吸舱内空气，在高压暴露前后也抽血。3名正常健康志愿者，2名男性和1名女性，平均年龄为53士3岁，也接受了2个小时的高压氧暴露。柠檬酸抗凝血16ml在Histopaque1077离心机上，400g，离心30分钟，分离白细胞，用PBS溶液冲洗。分离的白细胞用附有CD34抗体（DynalBiotech,LakeSuccess,NY）的顺磁聚苯乙烯有孔小珠进一步纯化得到CD34＋和CD34－细胞。细胞分离过程严格按照厂家推荐的方法进行，只是细胞黏附于有孔小珠时，只洗涤2次而不是3次。通常情况下，经有孔小珠系统筛选，CD34细胞的纯度可达90％，而从细4胞悬液中只能得到50％的CD34＋细胞。我们的目的是分别测定CD34＋和CD34－细胞的生长潜能。利用改良的分离方法，没有吸附在覆有CD34抗体有孔小珠的CD34细胞占所有单核细的1.4士0.4％，从有孔小珠上分离下来的细胞纯度达到75士4％。也就是说，有不到25%的单核细胞不表达CD34。为了进行流式细胞计数分析，洗涤后的单核细胞悬浮在250ulPBS+0.5%牛血清蛋白溶液中(BSA)。细胞先和兔IgG（250μg/ml）在4℃条件下孵育5分钟以封闭Fc受体，然后与饱和的R-藻红蛋白(R-phycoerythrin,RPE)连接的鼠抗人CD34抗体(Clone581,aClassIIICD34epitope;BDPharmingen,SanJose,CA)、标有荧光素同种硫氰酸盐(FITC)的鼠抗人CXCR4抗体（R&DSystems,Minneapolis,MN），以及标有同种藻青蛋白的鼠抗人VEGF-R2抗体（R&DSystems）或者标有同种藻青蛋白的CD133（MiltenyiBiotec,Auburn,CA）共同在4℃条件下孵育30分钟。用同配型的鼠免疫球蛋白作对照。然后PBS溶液洗涤细胞，残留的红细胞通过与155mM氯化铵、0.1mMEDTA和10mM碳酸钠（pH7.2）孵育溶解；离心后制成PBS细胞悬液。用Abramson肿瘤中心流式细胞核心设备FACScan流式细胞仪（BectonDickinson）进行流式细胞分析。用前方和侧方激光散射选定单核细胞，分析100，000个细胞中可能有干/祖细胞表面标记物表达的细胞。为了进行克隆形成细胞测定，单核细胞洗涤后悬浮于Metho-Cult克隆测定介质中（StemcellTechnologies,Vancouver,BC）。该介质含有甲基纤维素、L-谷氨酰胺、小牛血清、牛血清蛋白、重组人干细胞因子、粒细胞-单核细胞克隆刺激因子、5白介素-3和红细胞生成素。先在6孔Petri培养板上每一孔加入1ml悬液，在37℃，含有5％二氧化碳，完全湿化的空气条件下进行孵育。没纯化的单核细胞在浓度为100，000个细胞/培养板中培养，分离的CD34＋细胞则以50，000个细胞/培养板的浓度进行培养。在第14天克隆明显时，用倒置镜台显微镜计数。使用流式细胞仪和聚焦显微镜分析克隆形成细胞培养板中后裔细胞的表型。要收集克隆形成细胞培养板中的细胞，首先将5mlPBS＋0.5mMEDTA在培养板中与半软Metho-Cult介质混合，然后以500XG离心5分钟。将细胞团在PBS＋0.5%BSA中洗涤1次，一部分细胞如前面所描述的用流式细胞仪标记，另一部分细胞再次悬浮于生长介质中，并且在24孔的培养板中培养。细胞悬浮的介质60％为改良DulbeccoEagle介质（低糖；GibcoBRL,Rockford,MD），40％为MCBD-201介质(Sigma,St.Louis,MO)，以及下列添加剂（均购自Sigma公司）：1X胰岛素-转铁蛋白-硒、亚麻酸-牛血清蛋白、10－9M地塞米松、10－4M抗坏血酸-2-磷酸盐、100U盘尼西林和1000U链霉素。当细胞生长成团后从培养板上刮下，PBS洗涤，移至覆有多聚赖氨酸的显微镜玻片上。细胞以1％多聚甲醛固定10分钟，在4℃条件下以Tris液（10mMTris、250mM氯化钠、0.3％Tween20和1％牛血清蛋白）封闭1小时。然后细胞在4℃条件下用50ul1：1000鼠抗人VonWillebrand因子稀释液（PBS＋0.5％BSA）覆盖1小时，用PBS溶液洗涤2次后在4℃条件下与1：2500稀释液（Cy3连接的抗鼠类抗体和FITC连接的Ulexeuropaeus凝集素）衬染。用BioRadRadiance2000带有NikonTE300的倒置聚焦显微镜检测细胞（红色二极管激光，638nm；氪激光，6488nm和543nm）。高压氧对小鼠干细胞动员的影响：野生型和NO合酶基因敲除的小鼠（Musmuscalus，购自Jacksonlaboratoried,BarHarbor,ME），在宾夕法尼亚大学动物房饲养，喂给标准的啮齿动物饮食。小鼠暴露于高压氧环境90分钟（27，28）。在选择研究中，野生型小鼠在加压前2小时按40mg/kg腹腔内注射L-硝基精氨酸甲基酯。麻醉后的小鼠（腹腔内注射克他命，100mg/kg和甲苯噻嗪，10mg/kg）动脉穿刺取血标本，剪下股骨末端，以1mlPBS冲洗髓腔收集骨髓。除血细胞用Histopaque1083离心外，白细胞分离步骤基本上与前述的人类白细胞分离步骤相同。如前所述，用FITC连接的大鼠抗小鼠干细胞抗原-1和R-PE连接的大鼠抗小鼠CD34（均购自BDPharmingen公司）进行细胞表面标记物抗体的着色。鼠干细胞因子的测定，用R&D系统公司的QuantikineM免疫测定试剂盒按说明进行。用放置在股骨末端骨髓腔内的NO选择性微电极测定骨髓NO。小鼠麻醉后，暴露股骨，用25号针钻透骨皮质。用硬玻璃微吸管制成涂有Nafion的NO微电极（33）放在骨髓腔内，由一只微型操纵手臂控制。然后小鼠放在舱内行高压氧暴露。在选择性研究中，小鼠腹腔内注射硝普钠（4-8mg/kg），只呼吸空气而不是高压氧，观察这样是否会改变骨髓NO浓度，并使干/祖细胞动员。统计学处理：人类干细胞计数是通过Dunn，s检验、方差分析重复进行的，高压氧处理前后克隆形成细胞的统计分析使用t检验。小鼠干细胞动员的分析使用Dunn，s检验方差分析。P0.05为有统计学意义，结果的表述为均数士标准差。7结果：高压氧对人类干/祖细胞动员的影响：对为了防止放射性骨坏死而接受预防性高压氧治疗的患者，在第1次、第10次和第20次治疗前后分别抽血（术前预防性治疗标准为20次）。采集血中白细胞，通过流式细胞仪和克隆形成细胞分析干/祖细胞情况。流式细胞仪检测结果显示，患者对高压氧的反应有一定限度，三组患者的情况参见图1-3。图1的a图显示了来自于一个细胞样本的一幅典型的散点图。患者暴露于高压氧之前，血中只有极少数的CD34阳性细胞，CD34是最常用的干/祖细胞表面标记物。也只有极少数细胞表达血管内皮生长因子-2受体（VEGFR-2）、基质衍生生长因子受体（CXCR4），或另一个干/祖细胞表面标记物CD133。作为压力作用的对照，高压舱护理人员的细胞表面也极少有这些标记物的表达（图表1的c图，无CD133的数据）。图1的d图和e图比较显示，在第1次高压氧治疗后表达CD34的细胞数有了增加，随后的每次高压氧治疗后，