高效液相色谱仪的原理及应用.

第四章高效液相色谱仪的原理及应用高效液相色谱highperformanceliquidchromatograph，HPLCAgilent1100气相色谱法：较易挥发、且热稳定的有机化合物。～20%液相色谱法：用气相色谱法难以分析的物质，如难挥发、热不稳定、分子量大、具有生物活性的物质。～80%第一节高效液相色谱法的原理一、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相色谱法高效液相色谱仪经典液相色谱HPLC固定相粒径150-200μm3-10μm流动相驱动方式重力或低压泵高压泵流动相流速很慢快(1-10mL/min)例：分离20种氨基酸柱长：170cm柱径：0.9cmF：30mL/ht:20h经典柱色谱HPLCt：1h高压、高效、高速吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱二、高效液相色谱法的分类正相色谱反相色谱1、按分离原理分类2、按极性分类1)吸附色谱（液-固）固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相上的吸附与解吸。适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样。1、按分离原理分类2)分配色谱（液-液）固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；固定相：由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体表面涂渍固定液，固定液易流失，较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面。C-18柱:3)离子交换色谱固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：酸性或碱性水溶液；基本原理：利用不同离子对树脂的离子交换能力不同来实现分离。应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。4)排阻色谱（又称凝胶色谱）固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快。可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。1)正相色谱：是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的色谱体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。2)反相色谱：由非极性固定相和极性流动相所组成的色谱体系，与正相色谱体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今HPLC最主要的分离模式。2、按极性分类:第二节高效液相色谱仪的组成输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统一、输液系统高压输液泵脱气装置梯度淋洗系统1、高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。μL/min~几千mL/min应具有压力平稳、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2、脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。脱气机、超声脱气、真空脱气等。3、梯度淋洗装置等度洗脱输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂分析时间长分离度差MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2等度洗脱怎样解决呢？梯度洗脱A泵进样器色谱柱柱温箱检测器B泵AB时间B浓度95%30%MeOH梯度洗脱优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置：二、进样系统色谱柱：填料：C18色谱柱十八烷基硅基化学键合到多孔硅胶或陶瓷微粒SIL多孔硅胶微粒XDB-C8辛基硅烷化学键合到多孔硅胶微粒上三、分离系统目前应用最广、性能最佳的固定相。a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—Cc.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N化学键合固定相:1、紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。参考二极管UV灯光栅样品池采样二极管滤光片狭缝镜2镜1四、检测系统2、光电二极管阵列检测器DAD紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。3、荧光检测器高灵敏度、高选择性；对多环芳烃、维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。4、质谱检测器一、定性分析(1)保留值定性(2)相对保留值定性(3)与其他仪器联用标准品：A-甲醇；B-乙醇；C-正丙醇；D-正丁醇；E-正戊醇第三节高效液相色谱法的应用组分的峰面积越大,在样品中所占比例越大?1、校正因子定量：%100AA%100mmmm%c?n1iiin21iifi称为校正因子。fi＝0？同一检测器，对不同组分的敏感度不同。Wi=fiAiWi=fiAi二、定量分析方法：校正因子fi分为绝对和相对校正因子两种。绝对校正因子：iiiAWf由于受到仪器及操作条件的影响程度很大，实际定量分析时，基本上不使用。相对校正因子fi：某物质i与一选择的标准物质S的绝对校正因子之比:相对校正因子只与检测器类型有关，而与色谱条件无关。常用于作为标准物质S的有苯（热导检测器）和庚烷（氢火焰离子化检测器）等。ssiisi'iA/WA/Wfff选择的标准物质S一起加入试样中——内标法：2、内标法——标准物质在未知样内部Sis'iiAAWfW内标物应满足的要求（p55)：准确称取一定量的未知样Wi，加入已准确定量的内标物WS。SampleStandardsi100%AAfWW100%WW%cSiisii'总总A/WA/Wfffssiisi'i校正曲线：Ai/As～Ciis例：一含氯霉素试样，称取此样1.000g，以对硝基苯酚作内标，称取0.100g对硝基苯酚加到试样中，混合均匀后进样，测得氯霉素峰面积是20，对硝基苯酚峰面积是120，已知氯霉素相对于对硝基苯酚的相对校正因子是1.2，求试样中氯霉素的含量。ssiisi'iA/WA/Wfff：解fi′=（Wi/20）/（0.100/120）=1.2wi=0.020gCi=0.020/1.000=2.0%3、外标法——标准物质在未知样外部即标准曲线法。特点：不必使用校正因子。操作条件变化对结果准确性影响较大。对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。4、归一化法：100%)A(fAf100%i前提：所有组分都能从柱上洗脱并能被检测器检测。例1、高效液相色谱法测定奶粉中的三聚氰胺（1）提取：称取0.5~3g奶粉试样，加入0.1mol/L盐酸至15ml，混匀，超声提取30min后加入60g/L磺基水杨酸3~4ml，再用0.1mol/L盐酸定容至20ml，混匀后以4000r/min离心5min，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤后进样。（2）分析：色谱柱:色谱柱KromasilKR100-5C8(250mm×4.6mm，5μm，EkaChemicals公司，瑞典)柱温:40℃。流动相:缓冲液+乙腈(85+15，体积比);流速:1.0ml/min;进样量:20μl。二极管阵列检测器，波长范围200~400nm。例2、液相色谱法测定食品中苯并(a)芘原理：样品经过提取、皂化以及柱层析净化，除去脂肪类物质、色素等杂质后，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环芳烃物质中分离出来。求出样品中苯并芘的含量。仪器：(1)液相色谱仪：色谱柱：ODS柱，柱长250mm，Φ4mm；柱温：30℃；流动相：75％甲醇；流速：2mL／min。(2)检测器：荧光检测器，激发波长369nm，荧光波长405nm。操作步骤：(1)定性测定用微量注射器吸取一定量的苯并芘标准溶液和样液，注入色谱仪内，根据苯并芘的出峰保留时间和样品中加标准样产生重叠的情况进行定性。(2)标准曲线的绘制用微量注射器准确吸取每1mL含1μg的苯并芘标准溶液1、2、3、4、5uL按照上述实验条件进行操作，以获得相应的色谱图。然后分别测量各个色谱的峰面积，以峰面积为纵坐标，标准苯并芘量为横坐标，绘制标准曲线。(3)样品的测定：在上述实验条件下，吸取一定量经过柱净化的样品提取液，注入液相色谱仪中进行分离、分析，测得峰面积，然后从标准曲线上查出相应于此面积的苯并芘含量。例3、稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min流速：1mL/min柱温：50ºC柱压：70104Pa检测器：紫外检测器Waters515高效液相色谱泵，Waters717自动进样器，Waters2487双波长紫外检测器，联想数据处理机，Waters3.9X150mmC18不锈钢柱流动相：甲醇、水体积比30：70和15：85两种，超声波除气泡例4、鱼组织中喹乙醇残留量的检测无喹乙醇的鲤肌肉喹乙醇标准品含喹乙醇的鲤肌肉例5、中药质量检测芍药苷白芍药材血竭素血竭药材52实验四：高效液相色谱法测定水中的氯霉素7.2星期四5~8节科学楼3楼到实验室时间学号2：001-152：3016-293：0030-453：3046-58