高效液相色谱技术.

高效液相色谱法生命试验中心何海辉[e-mail]:3607335第一节概述高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法一、历史二、高效液相色谱仪流程图三、特点一、历史1906年俄国植物学家Tsweet创立色谱法30年代茨维特分离绿叶色素40年代TLC，纸色谱50年代GC出现使色谱具备分离和在线分析功能60年代末HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩大二、高效液相色谱仪流程图1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置续前三、HPLC的特点和应用“三高”“一快”“一广”高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）第二节基本理论和条件选择热力学理论：塔板理论——平衡理论基础动力学理论：速率理论——Vander方程一、塔板理论二、速率理论三、HPLC法中分离条件的选择HPLC法中分离条件的选择1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min3.柱温的选择：选室温250C左右第三节各类高效液相色谱法一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（BPC）一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂1。分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异2。固定相：（1）硅胶（2）高分子多孔小球：YSG3．流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂例：正己烷或庚烷+氯仿---5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱二、液液分配色谱法（LLC）分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异正相色谱——固定液极性流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱——固定液极性流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分三、化学键合相色谱法（BPC）（一）化学键合相（二）反相键合相色谱（三）正相键合相色谱（四）离子对色谱和离子抑制色谱（一）化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）2．特点：1）不易流失2）热稳定性好3）化学性能好4）载样量大5）适于梯度洗脱（二）反相键合相色谱1．分离机制：疏溶剂理论正相——流动相与溶质排斥力强，作用时间↑k↑，组分tR↑反相——流动相与溶质排斥力弱，作用时间↓，k↓，组分tR↓2．固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性固定相极性续前4．出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱5．适用：非极性~中等极性组分（三）正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相3．流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇（四）离子对色谱和离子抑制色谱1．反相离子对色谱法2．反相离子抑制色谱1．反相离子对色谱法（IPC或PIC）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离2．反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）第四节高效液相色谱仪（一）仪器构成1．泵：往复式恒流泵高压磁力泵2．进样装置1）阀进样：手动进样，六通阀2）泵进样：自动进样，体积无限制3）机械手进样：自动控制，批量分析续前3．色谱柱：直径4~6mm,柱长10~30cm柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4．检测器1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质灵敏度高3）示差折光检测器：利用折光率的差别灵敏度低，温度要求严格4）电化学检测器5）化学发光6）其他检测器：质谱检测器，核磁共振检测器，光电二极管阵列检测器（二）高效液相色谱仪的应用1。高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。2。与试样预处理技术相配合，HPLC所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展，有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。3。HPLC成为解决生化分析问题最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用,流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。（三）仪器1。规格型号：Waters600生产厂家：美国Waters公司系统组件：控制系统（Waters600）泵系统（WatersTMPump）紫外检测器（Waters2487）荧光检测器（Waters474）Waters600HPLC2。规格型号：HP1100生产厂家：Aglient（HP）仪器组件：微量自动进样器恒温装置紫外检测器Aglient1100系列泵系统变性高效液相色谱仪(dHPLC)3。规格型号：ÄKTAFPLC生产厂家：美国通用电气GE系统组成：控制系统（MonitorUPC-900）四元泵（Pump-920）混合仪MixerM-925进样阀Valve紫外检测仪（INV-907）部分收集器Frac-900快速液相色谱仪(FPLC)4。规格型号：ÄKTATMExplorer100生产厂家：美国通用电气GE仪器特点：流速范围宽广：0.001－100ml/min；12进口高精度缓冲液；3波长UV/可见光，pH，电导，压力，温度等自动实时监控；真正自动多维纯化：多柱，多样品，多缓冲液，多组份。ÄKTATMexplorer100快速纯化工艺开拓系统