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高效液相色谱一.简介仪器型号：Agilent1200HPLC高效液相色谱仪器厂商：美国安捷伦公司仪器性能：流速范围：0.001~5.0mL/min,0.001mL/min步进；压力范围：0-40MPa(0-400bar,0-5880psi)；梯度组成精密度：0.15%SD（1mL/min）。可测项目：可用于痕量分析，其检测限为ppb～ppm级。样品要求：样品一般需预处理。二、实验原理分配色谱原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。C18柱-反相HPLC（reversedphaseHPLC）：由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。荧光检测器（FLD）Agilent1200HPLC液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相（经过在线过滤器）以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。三、实验步骤开机1)将待测样品按要求前处理，准备HPLC所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。2)开机。打开电脑、HPLC各组件电源、打开软件。3)配置仪器（配置1200系统模块，根据需要配置）仪器自动配置。~1~4)打开工作界面，按操作要求赶流动相气泡。（排气：拧松泵阀（放置流动相的底下模块中黑色的旋钮，逆时针拧松），在“四元泵”模块内右击，点击“方法”选项，进入泵编辑画面，设流速：3-5ml/min，点击“OK”。点击“四元泵”图标内绿色圆圈，则系统开始走流动相，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，切换通道（A-B-C）继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。点击“四元泵”图标内红色圆圈，关泵。排完气泡后，记得把四元泵的泵阀拧紧。（放置流动相的底下模块中黑色的旋钮，顺时针拧紧）5)调整瓶填充：点击（左击）四元泵模块中，四个绿色瓶子中的任何一个。根据自己配置流动相的量改。装色谱柱1)如果别人的色谱柱未卸下，要小心卸下，把两端用白色的螺帽旋紧。2)先把四元泵打开，要液体从连接色谱柱前端的线路中流出后，再接色谱柱。连接时要确认色谱柱上流动相水流方向，切勿接反。如果有保护柱，应该分段连接。两端接上后，先打开泵小流速过柱0.5ml/min。在不漏的前提下，逐渐升高流速，直至你分析时需要的流速。3)色谱柱上卸下来的白色螺帽放置在柱温箱上面一格内。编辑方法及样品分析4)方法信息：从“方法”菜单中选择“编辑完整方法”点击“Ok”，进入下一画面。。点击“Ok”进入下一画面。~2~5)自动进样器参数设定:选择合适的进样方式,“标准进样”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“清洗后进样”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“进样程序”---可以点击“编辑”键进行进样程序编辑。点击“Ok”进入下一画面。6)泵参数设定：（以四元泵为例）在“流速”处输入流量,如1.5ml/min，在“SolventB”~3~处输入70,(A=100-B-C-D),也可添加”时间表”，编辑梯度。在“设置最高压力”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。点击“Ok”进入下一画面。注意点：如下图所示，如果保持前1.9min是百分之百的D相，需要如下两行设置。7)柱温箱参数设定:在”温度”下面的空白方框内输入所需温度,并选中它。8)DAD检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。Peakwidth（Responsetime）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit-狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。9)FLD检测器参数设定:激发A:激发波长:200-700nm,步长为1nm,或ZeroOrder。发射:发射波长:280-900nm,步长为1nm。键入你所需要的激发发射波长。如果需要在分析时间内改变波长的，需要添加一个时间表进行波长的转变。~4~序列的编辑10)序列参数信息：从“序列”菜单中选择“序列参数”保存路径，子目录改为自己的文件夹；关机菜单处，选中后序列命令/宏，下拉菜单中选择STANDBY。11)序列表的编辑：从“序列”菜单中选择“序列”，建立自己的序列表，整个序列表一般包括测试前洗柱子，走基线，测试样品，测试后洗柱子几个部分。12)通过追加行和插入增添列表个数。进样次数/瓶1；样品瓶按放置样品次序。试前洗柱子，测试后洗柱子样品瓶不用填写。进样次数填写“1”。13)序列表建立完成后，点击运行序列，运行该序列，等仪器显示ready，样品自行进行测试。数据分析1)从“视图”菜单中，点击“数据分析”进入数据分析画面。2)从“文件”菜单选择“调用信号”，选中您的数据文件名，则数据被调出。3)如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。关机1)退出化学工作站，依提示关泵，及其它窗口，关闭计算机。~5~2)关闭Agilent1200各模块电源开关。Agilent1200LC维护保养：1)色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（乙睛/甲醇适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）。2)流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。3)溶剂不能干涸。