高效液相色谱法

高效液相色谱法1HPLC测定条件色谱柱:ODS-2HYPERSIL(250mmX4.6mm,5um)不锈钢柱流动相:乙睛:KH2P04溶液(0.05mo1/L}(16:84,V/V}检测器:紫外吸收检测器检测波长:355nm柱温:25℃流速:1mL/min紫外检测器灵敏度:0.020AUFS进样量:20uL.2标准曲线及线性范围用流动相将土霉素贮备液分别稀释成80mg/L,40mg/L,20mg/L,10mg/L,5mg/L等几个浓度。用高效液相色谱仪检测各稀释样品。每次进样量为20uL(进样阀定量)，每次处理重复5次。取峰面积的平均值作标准曲线，并求得回归方程。3样品处理取配制好的无机盐培养基2mL，加入6mLMcllvaine缓冲液，然后分别加入1mL正己烷，1mL三氯甲烷，涡旋混合2min，超声30s使均质，4500r/min离心10min，上清液经0.45um水系微孔滤膜过滤，滤液用于HPLC分析。4回收率的测定加入一定浓度的土霉素标准工作液于空白无机盐培养基中，制得土霉素浓度为1,10,50mg/L，旋涡混匀，经2.2.3项下的方法处理后，取上清滤液20uL进行HPLC分析。同时按土霉素的加入量计算上清滤液中土霉素的实际浓度(土霉素实际浓度为0.25,2.5和12.5mg/L，再取一定量的土霉素标准贮备液用流动相配成对应的标准工作液浓度(土霉素浓度为0.25,2.5和12.5mg/L，进样20uL作HPLC分析，用下面公式计算各浓度的添加回收率。每一浓度做5次重复。回收率的计算公式为:回收率一二x100%AS注:式中A为无机盐培养基中土霉素的峰面积，As为相应标准工作液中土霉素的峰面积。5精密度的测定加入一定浓度的土霉素标准混合工作液于空白无机盐培养基中，制得培养基中土霉素浓度为1,10,50mg/L，经2.2.3项下的方法处理后，取上清滤液20uL进行HPLC分析，每批次(同日内)各浓度的样品重复测定5次，得出土霉素的峰面积，用标准曲线回归方程计算培养基药物浓度，求出日内变异系数。在一周内共进行5个批次测定，根据土霉素的峰面积，用标准曲线回归方程分别计算出培养基药物浓度，求出日间变异系数。6定量方法数据处理系统可以自动计算峰面积，根据添加到无机盐培养基中的药物对照品的浓度与峰面积作出标准曲线，将每个待测样品的峰面积代入标准曲线，可算出各自的浓度。将样品峰的保留时间与对照品的保留时间比较，确定样品中土霉素保留时间与出峰位置，对样品中土霉素定性。