高效液相色谱结合化学发光的简要介绍

高效液相色谱结合化学发光的简要介绍摘要：目前，高效液相色谱(HPLC)法由于对复杂样品中的分析物具有极高的分离效率而成为最有效的分离方法。将具有高灵敏度的化学发光分析法和具有高分离效率的高效液相色谱分离法相结合已引起了国内外分析化学家的极大兴趣。本文简单概述了高效液相色谱化学发光的特点、发展史、检测原理、化学发光反应体系以及发展前景。关键词：高效液相色谱化学发光1.引言高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，HPLC）是一种具有高效、快速及应用广泛的现代分离技术，它是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论和技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及较高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法己经成为有机物质分析的支柱技术，在生物化学、临床医学、食品检验、石油化工及环境污染监测等领域得到广泛的应用，成为分析化学家和生物化学家用以解决他们面临各种实际分析和分离必不可缺的工具。与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。高效液相色谱仪是由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。从上个世纪70年代以来，人们经过努力已研究和开发了多种检测器，如紫外-可见光检测器(UV一Vls)、光电二极管阵列检测器(PDA)、荧光检测器(FLD)、示差折光检测器(RID)、电化学检测器(ECD)、蒸发激光散射检测器(ELSD)、光电导检测器(PCD)、磁旋光检测器(MDR)、放射性检测器(RD)、热离子化检测器(TID)、化学发光检测器(CLD)和质谱(Ms)检测器等等。随着色谱技术的发展，结合计算机各种软件的开发，使HPLC与各种检测仪器联用。在众多的HPLC检测器中，化学发光检测器(CLD)结构简单，灵敏度高。在大多数情况下，它的灵敏度比紫外一可见光检测器高2-3个数量级，由于它没有光源，不存在散射光引起的背景，用于荧光物质检测时，灵敏度比荧光检测器更高，对某些物质的检测甚至可与激光诱导荧光检测器媲美，灵敏度可达10-21mol的单分子水平。将高灵敏度的化学发光检测器与高分辨的高效液相色谱(HPLC)分离手段以适当的方式相祸合，集分离与分析之精华于一体，发展成为一种理想的分析方法。2.高效液相色谱化学发光检测的原理化学发光是指在没有任何光、电、热的作用下，只是由于反应体系中某种物质(反应物、产物、中间体或荧光物质)的分子吸收了反应所释放的能量而由基态跃迁至激发态，然后再从激发态返回基态，同时将能量以光辐射的形式释放出来，产生化学发光的现象。在固相、液相、气相反应中均能观察到化学发光。常用的化学发光反应可归纳成两类，第一种类型，反应物A和B反应生成激发态的C，激发态的C回到基态时产生光辐射。A+B→C*C*→C+hv第二种类型，反应物A和B反应生成激发态的C，激发态的C把能量转移光物质F，激发态的F回到基态产生光辐射。A+B→C*C*+D→C+D*D*→D+hv可见任何一个化学发光反应都包括两个关键步骤：激发和发射。因此，能产生化学发光的反应必须满足以下几个条件：第一是反应必须能够提供足够的激发能。通常只有那些反应速度相当快的放能反应，其焙变介于170-300kJ/mol之间，才能在可见光范围内观察到化学发光现象。第二是化学反应的能量至少能被一种物质所接受并产生激发态。最后，处于激发态的分子或原子能够释放出光子或者将其能量转移给另一个分子，使此分子激发，然后以辐射光子的形式回至基态。一个化学反应要产生化学发光必须满足以下条件：第一是该反应必须能够提供足够的能量且可以被某种反应产物或是中间体吸收，使之处于激发态，在许多氧化还原反应中所提供的能量都能满足此条件，因此大多数氧化还原反应都是化学发光反应；第二，是化学反应的能量至少能被一种物质所接受并使之生成激发态。对于有机分子的液相化学发光而言，从能量上看，容易生成激发态产物的往往是一些芳香族化合物和拨基化合物；第三，处于激发态的分子或原子必须具有一定的化学发光量子效率使其能释放出光子，或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子。由此可见，能够用于HPLC柱后检测的化学发光是由一些高能量、不放热、不做电功或其它功的化学反应所释放的能量，去激发体系中某些化学物质分子而产生的次级光发射132]，利用产生的化学发光来对经色谱分离的被分析化合物进行测定3.高效液相色谱中的化学发光反应体系化学发光不需要外加光源和灵敏度高两大特点使化学发光分析成为微量检测法研究的热点。但这种高灵敏分析方法在实际应用中由于其固有的选择性差的缺点受到很大限制。而高效液相色谱，具有分离效能高，分析速度快等特点。将高灵敏的化学发光与高效能、高分辨的高效液相色谱技术相结合，集两种技术之精华于一体，则形成一种有效的痕量及超痕量的高效液相色谱一化学发光分析检测技术，从而克服了化学发光选择性差的缺点，己经成为一种理想的分离分析方法，日益得到了人们的重视。到目前为止，柱后化学发光反应体系主要有鲁米诺及其衍生物（Luminolderivatives）发光体系、过氧化草酸酯(Peroxyoxalates)发光体系、三（2,2’-联呲啶）钌（Ⅱ）[Tris(2,2’-bipyridyl)Ruthenium(Ⅱ)](电)化学发光体系、高锰酸钾化学发光体系，此外光泽精(Lucigenin)、吖啶酯(AcridiniumExter)、铁氰化钾、Ce(Ⅳ)等发光体系也在HPLC-CL的柱后检测中的使用也不断增多。4.结论及展望液相色谱化学发光检测是将化学发光的高灵敏度、设备简单、线性范围宽等优点和液相色谱的高分离效率相结合，同时提高了化学发光检测的选择性。化学发光检测法是灵敏的检测方法之一，比普通荧光检测器一般高出两个数量级，但某些CL反应体系与色谱体系相祸合的条件需要进一步研究和优化。为了拓宽分析物的范围，与红外、质谱、NMR的联用及其衍生化技术的深入研究仍是十分重要的。如何对实际样品提供出可靠定量数据，并且研制出自动化程度高，灵敏度更好的化学发光检测器并使所研制的检测器商品化，也是今后的目标之一。此外，HPLC-CL检测技术在我国目前主要以获得新原理、新技术、新方法为主要目的的研究居多，大都还只限于实验室研究水平，尚未把该技术完全投入到实际应用中。一旦所建立的分析方法在选择性、灵敏度及操作方便方面达到实际应用水平，仅仅在污染物检测的环保领域所产生的社会效益和经济效益将是非常巨大的，不仅如此还可以应用到生化、医药、工业、农业、商检、法检等诸多领域中复杂、低含量组分的检测与研究中。这一检测技术在痕量及超痕量分析研究和应用中会显示其巨大的潜力，其直接经济效益和间接经济效益均很明显，因而具有十分广阔的应用前景。参考文献[1]L.Gamiz-Gracia，A.M.Gareia-Campana，J.J.Soto-Chinchilla，J.F.Huertas-Perez，Gonzalez-Casado.AnalysisofPestieideschemiluminescencedetectionintheliquidPhase[J].TrendsinAnalyticalChem，2005,24(11):927-942.[2]YueWei，ZhujunZhang，YantuZhang,YonghuaSun.SimpleLCMethodwithChemilurninescenceDetectionforSimultaneousDeterminationofArbutinandL-AscothieAcidinWhiteningCosmoties.Chromatographia，2007,65(7):443-446.[3]魏月，章竹君，孙永华，张瑛图.高效液相色谱化学发光法测定淫羊霍贰[J]，陕西师范大学学报(自然科学版)，2006,34(3):62-64.[4]E.Nalewajko，A.Wiszowata,A.Kojlo.Determinationofcatecholaminesbyflow-injectionanalysisandhigh-performanceliquidchromatographywithchemiluminescencedetection[J].JournalofPharmaceuticalandBiomedical.Anaiysis，2007,4(5):1673-1681.[5]卫洪清，刘二保，张敏.高效液相色谱一化学发光法在药物分析中的运用[J].山西师范大学学报(自然科学版).2005,19(2):58-60.[6]王莉，周光明，游水英，沈祥.反相高效液相色谱-增敏化学发光测定vB6[J1.食品工业科技，2006,27(3):181-183.[7]林金明.化学发光色谱柱后检测技术及其应用[J].色谱，2003,21(4):324-331.[8]]周如梅.高效液相色谱及其应用[J].企业技术开发，2005,24(6):36-38.[9]张淡图，章竹君孙永华.高效液相色谱化学发光法检测牛奶中残留四环素类化合物的研究[J].化学学报，2006,64(24):246-2466.[10]范顺利，张立科，魏彦林，林金明.高效液相色谱-高锰酸钾氧化化学发光法测定水中的痕量苯二酚[J].色谱，2006,24(2):148-151.