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实验一蛋白质分子量的测定—凝胶层析法一、原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi。式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi。上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好是有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求得；Vi可由g×Wr求得（g为干胶重量，单位为克；Wr为凝胶的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积Vo，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为Vo时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为Vo+Vi时，出现洗脱峰。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1-K2logM，式中M为相对分子质量，K1和K2为常数,Ve也可用Ve-Vo。二、仪器和试剂1.标准蛋白质:蓝色葡聚糖-2000（200KD）、牛血清蛋白（67KD）、胃蛋白酶(36KD)、CytC(13.7KD)等，均为分析纯。2.仪器:层析柱核酸蛋白检测器（或紫外分光光度计）、自动部分收集器、刻度管。3.试剂:蓝色葡聚糖2000、SephardexG-75、洗脱液：0.2mol/LTris-HCL-KCL,PH7.5。三、实验步骤测定蛋白质的分子量根据需要可选用SephadexG-75、G-100或G-150型凝胶，凝胶颗粒一般在40—120微米，柱管选用直径1.0-1.3cm，高90-100cm。1.标准曲线的制定：层析柱用1.2100cm，凝胶用SephadexG-75或G-100。（1）蛋白质标准样品混合液：分别称取4mg蓝色葡聚糖-2000（200KD）、牛血清蛋白（67KD）、胃蛋白酶(36KD)、CytC(13.7KD)共同溶于2mlPH7.50.025mol/LTris-Hcl缓冲液中。（2）上柱和洗脱：将标准样品混合液上柱，然后用PH7.50.025mol/LTris-Hcl缓冲液洗脱，流速15d/min，2ml/管，用部分收集器收集，紫外检测仪280nm出检测，或收集后用紫外分光光度仪于280nm出测定每管OD值，以管号（或洗脱体积）为横坐标，0D值为纵坐标绘出洗脱曲线。根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积（Ve）。然后以蛋白质分子量的对数（lgM）为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。为了结果可靠，应以同样条件重复1-2次，取Ve平均值作图。2.未知数品分子量的测定：完全按照标准曲线的条件操作，根据紫外线检测的洗脱峰位置，得出体积。重复1-2次，取其平均值，由标准曲线可查得样品的分子量。四、实验结果牛血清蛋白蓝色葡聚糖-2000Ve（ml）OD值Ve（ml）OD值00.04100.03920.04120.00640.1640.0056060.00180.0180100.025100.015120.223120.341140.115140.15160.039160.07180.12180.048200200.04胃蛋白酶CytcVe（ml）OD值Ve（ml）OD值00.0270020.02920.00740.02440.02160.02660.01980.02680.018100.031100.076120.039120.185140.131140.252160.304160.215180.315180.118200.676200.077220.105220.057240.042240.047260.02260.034280.07280.025300.05300.013320320.01340.008作出洗脱曲线：牛血清白蛋白蓝色葡聚糖-2000胃蛋白酶Cytc绘出标准曲线如下：五、讨论1.从洗脱曲线上可以看出，出现了四个较明显的峰值（实验结果较为理想）：OD:0.233(Ve=12ml)，0.341（Ve=12ml），0.676（Ve=20ml），0.252（Ve=14ml），分别对照试验中所加样的四种蛋白质。由于分子量大的先洗脱出来，小分子量的蛋白后洗脱出来，因此洗脱顺序是蓝色葡聚糖-2000（200KD），牛血清白蛋白（67KD），胃蛋白酶（36KD），Cytc（13.7KD）。可能由于洗脱体积间差距较小，且每管体积为整数，导致牛血清蛋白和胃蛋白酶之间洗脱体积差距未能体现出来2.有标准曲线可以看出胃蛋白酶峰值出现的体积与其它三种样品差距较大，不太符合正常规律，猜测可能是由于实验过程中的操作不规范造成的。另外实验过程中，可能由于加样时凝胶柱上层部分遭到轻微破坏，导致部分数据不太准确。