高精料日粮对奶牛肝脏氨基酸代谢的影响

高精料日粮对奶牛肝脏氨基酸代谢的影响-校样稿姜发彬，袁庆启，王亚琼，沈向真，庄苏（1.南京农业大学动物科技学院，江苏南京210095；2.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095）摘要：研究高精料日粮条件下奶牛肝脏氨基酸代谢分配的规律。选择6头泌乳期中国荷斯坦奶牛（体重550±20kg）作为试验动物，采用交叉试验设计，试验动物随机分成两组并提供不同精料水平的饲粮，分别手术安装瘤胃瘘管和门静脉、肝静脉、股动脉慢性血管瘘用于收集试验样本。在采样期，分别在采食前(0h)以及采食后2、4、6、8h采集门静脉、肝静脉、股动脉的血液用于血浆中氨基酸的浓度测定。结果表明：高精料日粮显著增加门静脉血浆中蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸和组氨酸等必需氨基酸（EAA）以及丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和精氨酸等非必需氨基酸（NEAA）的浓度（P0.05），提高门静脉血浆中支链氨基酸（BCAA），总必需氨基酸（TEAA），总非必需氨基酸（TNEAA）以及总氨基酸（TAA）的浓度（P0.05）。除了亮氨酸和苏氨酸，高精料日粮组肝静脉血浆中其他EAA的浓度显著高于低精料日粮组（P0.05）。高精料日粮显著肝静脉血浆中酪氨酸和天冬氨酸和BCAA、TEAA以及TAA浓度（P0.05），以及趋向增加苏氨酸、精氨酸浓度（P=0.08）。相比于低精料日粮，高精料日粮均显著增加股动脉血浆中除亮氨酸外其它EAA浓度（P0.05）；对于非必需氨基酸（NEAA）而言，高精料日粮组股动脉血浆中酪氨酸、天冬氨酸和精氨酸浓度显著高于LC组（P0.05）。高精料日粮显著提高股动脉血浆中BCAA、TEAA和TAA浓度（P0.05），但对TNEAA浓度没有显著影响（P0.05）。关键词：奶牛;高精料;肝脏;氨基酸中图分类号：S823.9文献标志码：B文章编号：反刍动物的蛋白质供应主要依靠日粮中粗蛋白的降解以及瘤胃中微生物合成的蛋白，这些蛋白对于动物机体的维持、生长和泌乳的需要有重要的作用。饲料蛋白经胃肠道消化后转变成游离的氨基酸，这些氨基酸随血液汇集于门静脉进入肝脏。肝脏是氨基酸主要的代谢器官，它不仅能分解、转化门静脉吸收的氨基酸（aminoacids,AA），也能合成外周组织所需的蛋白质；同时肝脏糖异生作用也能够利用AA作为前体物[1-2]。日粮组成以及动物生理状态都能够影响AA在肝脏中的转化效率和代谢情况。研究表明，奶山羊日粮中粗蛋白水平的的增加能够提高肝脏门静脉血浆和动脉血浆的AA流量[3,4]；当反刍动物处于泌乳期，AA在肝脏中分解和合成代谢也会发生改变[5]。但关于高精料日粮对肝脏AA代谢情况的研究较少。本试验以泌乳中期奶牛为试验动物，提供不同精料水平日粮，以期对反刍动物肝脏氨基酸的基础代谢情况有进一步的了解。1材料与方法1.1试验动物及日粮选择6头（体重550±20kg）安装永久性瘤胃瘘管和门静脉、肝静脉及股动脉血管瘘[10]的健康泌乳中期奶牛为研究对象。每日在6:00，12:00和18:00三次饲喂并挤奶（6:00、18:00），动物自由饮水。以玉米、豆粕、燕麦青贮、苜蓿干草及羊草为主要原料配制精粗比为6:4（高精料组）和4:6（低精料组）两种水平日粮，日粮组成及营养水平见表1。注：①预混料为每千克日粮提供：维生素A7500IU，维生素D1250IU，维生素E18mg，烟酸25mg，铜14mg，铁56mg，锌96mg，锰40mg，碘1.2mg，硒0.3mg，钴0.6mg。②净能根据NRC计算而来,其余均为实测值。③NFC(%)＝100-NDF-CP-Fat-Ash.1.2试验设计本试验采用交叉设计设计。试验动物被随机分为2组，每组3头；试验共分为2期，每期18d，包括预试期15d，采样期3d。1.3样品采集血样采集：在采食前（0h）与采食后2、4、6、8h分别从门静脉、肝静脉、股动脉血管插管中抽取血液5mL，血样用肝素钠（3.6U/mL血）进行抗凝处理后迅速转移至实验室，在4℃下以4000r·min-1离心15min，制取血浆，血浆于-20℃下保存用于后期分析。记录早晚两次的产奶量，以此计算日均产奶量。乳成分含量测定使用JulieZ9乳成分自动分析仪。1.4氨基酸的测定混合氨基酸标准浓度的测定：取1mL氨基酸标准溶液于氨基酸进样瓶中，在血浆样品分析前测定（日立-8900氨基酸自动分析仪）。血浆样品处理：取血浆样品200μL与50g/L的磺基水杨酸按1:1体积比混合，涡旋混匀后于4℃冰箱静置15min，然后在4℃条件下以20000r/min、离心20min，最后用1mL一次性注射器吸取上清液，经过0.22μm的滤器过滤到氨基酸加样瓶中用于氨基酸测定。1.5数据处理与统计分析试验数据经Excel2003初步处理后，再采用SPSS18.0统计软件中的一般线性模型（GLM）进行差异显著性分析，P0.05判为差异显著。注：TEAA：总必需氨基酸包括：蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和组氨酸；TNEAA：总非必需氨基酸包括：丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和精氨酸；BCAA：支链氨基酸包括：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；TAA：总氨基酸包括：必需氨基酸和非必需氨基酸。P-D:日粮效应;P-T:采样时时间效应;P-D*T:日粮与采样时间交互作用;SEM:平均标准误。下同。2结果与分析2.1不同精粗比日粮对门静脉血浆中氨基酸浓度的影响由表2可见，与LC日粮相比，HC日粮显著增加门静脉血浆中蛋氨酸（Met）、赖氨酸（Lys）、异亮氨酸（Ile）、苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）和组氨酸（His）等EAA以及丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、天冬氨酸（Asp）和精氨酸（Arg）等NEAA的浓度（P0.05），提高门静脉血浆中支链氨基酸（branched-chainaminoacids,BCAA），总必需氨基酸（TotalEAA,TEAA），总非必需氨基酸（TotalNEAA,TNEAA）以及总氨基酸（TotalAA,TAA）的浓度（P0.05），其中门静脉血浆中BCAA和TEAA的浓度还受采样时间的影响。2.2不同精粗比日粮对奶牛肝静脉血浆中氨基酸浓度的影响由表3可知，在EAA中，除Leu和Thr外，HC日粮显著肝静脉血浆中其他EAA浓度（P0.05），并且Thr浓度也有增加的趋势（P=0.08）。而在NEAA中，HC日粮显著增加肝静脉血浆中Tyr和Asp浓度，以及增加Arg浓度的趋势（P=0.08），而对其他NEAA浓度没有影响（P0.05）。HC日粮显著提高肝静脉血浆中BCAA,TEAA以及TAA的浓度（P0.05）。除采用时间对Ile、BCAA和TEAA有影响外，血浆中其他氨基酸浓度均不受采样时间、日粮和采用时间互作的影响2.3不同精粗比日粮对奶牛动脉血浆中氨基酸浓度的影响由表4可知，在股动脉血浆中，HC日粮均显著增加动脉血浆中除Leu外其他EAA浓度（P0.05）；对于NEAA，相比LC日粮，HC日粮组动脉血浆中酪氨酸Tyr、Asp和Arg浓度显著增加（P0.05）。HC日粮组股动脉血浆中BCAA、TEAA和TAA浓度显著增加（P0.05），但对TNEAA浓度没有显著影响（P0.05）。除TEAA外，采用时间以及日粮与采样时间之间的互作效应对动脉血浆中氨基酸浓度均无影响。3讨论饲料蛋白中一部分在反刍动物瘤胃中被瘤胃微生物转变生成微生物蛋白（MCP）以及未被瘤胃微生物降解的蛋白一起经胃肠道组织的消化吸收后以氨基酸（AA）或肽[6]的形式汇总至门静脉进入肝脏，在肝脏组织中经过代谢后再经肝静脉输出进入后腔静脉，最终通过动脉送至全身组织利用[7]。日粮中精饲料比例和非结构性碳水化合物（NSC）、蛋白在瘤胃中的降解效率影响瘤胃微生物蛋白的产量[8,9]。门静脉对AA的吸收量与瘤胃微生物蛋白的产量及肠道对AA的吸收量有关[10]。随着日粮中蛋白水平的提高，瘤胃中日粮蛋白的降解率以及过瘤胃蛋白量相应提高，并且肠道中游离氨基酸和肽氨基酸的浓度也增加[11]，门静脉吸收的必需氨基酸（EAA）也随之增加[12]。在本试验中，HC组日粮中粗蛋白含量与净能分别比LC组高3.33%和8.06%，当奶牛采食高精料日粮后，门静脉血浆中Met等6种EAA和Ser等6种非必需氨基酸（NEAA）以及支链氨基酸（BCAA）、总必需氨基酸（TEAA）、总非必需氨基酸（TNEAA）浓度显著提高，说明随着日粮中精料比例的提高，特别在本试验中日粮蛋白水平接近，高精料日粮能量略高情况下，NSC中可溶性淀粉及糖类能够增加瘤胃微生物可利用的底物量，使瘤胃微生物生长速率加快，MCP的合成效率提高，同时过瘤胃蛋白量也有所增加，从而提高了对肝脏门静脉AA的供应量。通过门静脉吸收的AA在肝脏内分解或氧化，同时各种AA的代谢转化量不同将显著影响外周循环AA的组成[13,14]。Wray-Cahen等[15]肠系膜灌注AA试验表明，NEAA中肝脏代谢量最大的是Ala和Gly，其次是Tyr、Ser，而EAA中，Phe和Met的代谢量最大，而Val、Leu和Lys则较低。Raggio等[16]对泌乳奶牛内脏AA代谢的研究也发现同样的规律。AA在肝脏中的转化率不同与参与AA分解代谢的氧化酶的差异有关。Lobley等[17]认为肝脏中缺少分解BCAA的酶，导致BCAA的代谢受限。而肝外组织却存在这些关键酶而能够有效利用BCAA，包括肌肉组织、脂肪组织[18]。本试验中，除Glu外，HC日粮和LC日粮组肝静脉各AA浓度均低于门静脉血浆AA浓度，这一结果符合AA在肝脏中的代谢规律；并且在两种日粮条件下，肝脏门静脉血浆中TNEAA浓度均大于TEAA，但肝静脉血浆中NEAA浓度相差无几，分别为642.21μmol/L和676.66μmol/L，推测与日粮影响肝脏内非必需氨基酸的转化代谢有关。研究表明，随着日粮中精饲料比例的增加，肝脏中参与蛋白质代谢的延长因子-Tu、谷氨酸脱氢酶和腺苷高半胱氨酸酶上调，氨基酸分解代谢加强[19]；被肝脏摄取的NEAA常被用来为糖异生过程提供碳源[20]，包括Ala、Gly以及Glu，或者作为NH3的载体转运肝脏内产生的大量NH3[21]；Hanigan等[22]也认为肝静脉释放的AA模式不同于门静脉和动脉，而造成这种差异的原因主要是来着NEAA的变化。动脉血浆中的AA对供应机体外周组织及乳腺氨基酸需要有重要作用，它能够以游离AA或肽的形式为肌肉[23]、乳腺[24]等肝外组织的蛋白质合成提供所需的氨基酸。例如，肝脏中转化率较低的Leu、Lys能够供应乳腺合成乳蛋白的需要[25]；Varvikko等研究表明，Met在乳脂合成中有重要作用，而Lys是乳中NEAA的合成的一种底物[26]，His和Phe均能以小肽的方式参与乳蛋白的合成[27]。十二指肠小肽灌注试验表明，乳腺组织能够吸收动脉血液中的以肽形式存在的EAA和NEAA[28]。BCAA能够刺激骨骼肌蛋白的合成以及抑制其分解，其中Leu能够抑制蛋白质水解酶活性，进而抑制肌原纤维蛋白的降解[29]。BCAA氧化产生ATP的供能效率一般要高于其他氨基酸，而生理状态不同（比如饥饿、泌乳、疾病等），BCAA的作用则更加凸显[30]。本试验结果显示，高精料日粮显著提高动脉血浆中BCAA、TEAA和TAA浓度，说明高精料日粮能够提高机体循环血液中AA的浓度，这将有益于外周组织吸收利用更多的氨基酸。参考文献[1]LobleyGE,ConnellA,LomaxMA,etal.Hepaticdetoxificationofammoniaintheovineliver:possibleconsequencesforAAcatabolism[J].BritishJournalofNutrition,1995,73(5):667-685.[2]LobleyGE,ConnellA,RevellDK,etal.Splanchnic-bedtransfe