染色体工程

第八章染色体工程山东师范大学生命科学学院染色体变异染色体结构变异①染色体易位：一个染色体上某一区段与另一非同源染色体上的区段发生互换。②染色体缺失：染色体的某一区段及其带有的基因一起丢失③染色体倒位：染色体上某一区段连同它带有的基因顺序发生180度倒转。④染色体重复：一个染色体上增加了相同的某个区段。染色体变异染色体数变异①一是体细胞内以染色体组为基数进行的整倍性变化，以整倍体染色体数目变化产生的变异会产生多倍体和单倍体；②另一种是染色体组内的个别染色体数目有所增减，使细胞内的染色体数目不是基数的的完整倍数，因此被称为非整倍体。什么是染色体工程？染色体工程（chromosomeengineering）是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。人工诱导多倍体雌、雄核发育染色体显微操作技术染色体介导的基因转移技术人工染色体第一节人工诱导多倍体多倍体（polyploid）这个名词是由Winkler（1916年）首先使用的，它是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体而言。染色体组成多倍性现象在高等植物中相当多，但动物界的多倍体现象却少得多。自从60年代发现一种美洲角蛙是一个确定的四倍体动物以来，学者们陆续在低等脊椎动物中发现许多多倍体动物，包括鱼类、两栖类和爬行类。由于多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体、改善动物经济性状倍受重视一、人工诱导多倍体的方法生物学方法Rasch等（1965）年首次证明了三倍体脊椎动物可以通过杂交产生，他们将雌核发育的二倍体帆鱂（Poeciliaformosa）与P.Vittate杂交，得到三倍体后裔。雌性草鱼（2n=48）与雄性三角鲂（2n=48）杂交获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体，其中草鱼提供了二倍数目的染色体（48），三角鲂提供了单倍数目的染色体（24）。异育银鲫与兴国红鲤杂交获得的复合四倍体，通过细胞方法证明其产生的原因是受精卵发生了两性融合。为什么种间杂交会导致第二极体不排出，从而导致多倍体产生？人工诱导多倍体的方法物理学方法温度休克法：包括冷休克法和热休克法两种，即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。此法廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于养殖场大规模生产使用。水静压法：就是采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。此种方法诱导率高（90%~100%）、处理时间短（3~5min），对受精卵损伤小、成活率高。但该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产。人工诱导多倍体的方法化学方法细胞松驰素B：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂。秋水仙碱：可以抑制细胞分裂中纺缍丝的形成，因而抑制有丝分裂。其它药物：N2O和聚乙二醇等。二、多倍体倍性鉴定的方法核体积测量：二倍体/三倍体核体积之比为1:1.5，二倍体与四倍体的核体积之比为1:1.74。蛋白质电泳：生化分析：如在关东系银鲫中，三倍体红血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍体。染色体计数：是鉴定多倍性的一个准确的直接方法。DNA含量测定：流式细胞仪。染色体直接计数法准确、直接，但费时；红细胞体积测量法省时、简单，在生产现场就能进行而广为人们采用，但缺乏准确性，亦测不出嵌合体，往往需要校正；DNA含量测定法是较为先进常用的方法，其测定快速准确，并能测出嵌合体，但需要特殊的仪器设备。三、多倍体动物的应用及发展趋势多倍体动物的生活力及生长能力。许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等都具有良好的生存力和生长率。诱导三倍体可以增加种间杂种的成活率，三倍体种间杂种可以比二倍体杂种成活得更好一些。多倍体动物的应用及发展趋势多倍体动物的性腺发育及其应用三倍体预期是不育的，许多实验也都证明了这一点。生产上可以利用这个不育特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长上，避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，也避免了生长停滞和死亡率的增高，缩短了养殖周期、减少了养殖成本，可养成大型个体。与三倍体不同，四倍体是可育的。目前如何大量诱导四倍体并培育至性成熟，尔后与正常二倍体杂交获得不育的三倍体，进行三倍体育种是许多学者正在致力研究的课题。多倍体动物的应用及发展趋势多倍体动物的其它经济性状三倍体虹鳟的鱼肉质量确实优于二倍体，其抗传染性造血器官坏死病毒能力较强；三倍体大西洋鲑耐低氧，故可适用于低氧环境养殖；三倍体香鱼对声音和光线的感受能力比二倍体香鱼略显迟钝，适于在噪音较大的环境中放养。四、多倍育种中存在的问题准确的处理时间；诱导率、成活率及孵化率的提高；准确可靠的倍性鉴定方法的确定。第二节雌、雄核发育雌核发育（gynogenesis）是单性生殖的一种，指卵子依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为。同种或异种精子进入卵内只起刺激卵子发育的作用，不形成雄性原核和提供遗传物质，其子代的遗传物质完全来自雌核，只具有母本的性状。雄核发育（androgenesis）是指因经过紫外线、X射线或γ射线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育为完全为父本性状的二倍体。首先将两个不同品系的近交系进行杂交。交配后，在精核与卵核尚未融合之前，从母鼠子宫内冲取受精卵，并用极细的吸管将精核去掉。在细胞松驰素B的处理下使雌核加倍，形成二倍体细胞。二倍体细胞在体外培养到囊胚期后，移植到养母的子宫内，使胚胎继续发育，直至出生。一、人工诱导雌核发育的方法精子遗传物质的失活：物理方法：采用物理辐射如γ射线、X射线和紫外线等处理精子使精子的遗传物质失活。化学方法：采用化学物质如甲苯胺蓝、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色体遗传活性的方法。显微手术法：采用显微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。人工诱导雌核发育的方法雌核染色体的二倍化温度休克法流体静水压法化学试剂处理如细胞松驰素B二、雌核发育的鉴别形态生化细胞学三、雌核发育的意义雌核发育具有产生单性种群的能力。雌核发育能迅速地产生同源型二倍体克隆。广泛地用于进行基因——着丝点的定位研究。第三节染色体显微操作技术染色体的分离染色体的微切割染色体分离的基本原理由于荧光染料Hoechst只对A-T特异性染色，而染料Chromomycin只对G-C特异性染色。染色体上DNA的碱基序列是不同的，因此这些特异性染料和不同染色体上DNA结合的量和比例是不同的。结合这些染后，再经激光照射，染色体就会呈现不同的荧光带。将特定染色体发出的荧光波长输入计算机，通过计算机控制就可将发出同一波长的染色体收集在一起，从而实现染色体的分离。细胞分裂同步处理染色体的荧光色素染色染色体的分离染色体微切割最常用的方法有两种微细玻璃针切割法：采用特细的玻璃针（尖端直径约为0.17μm）在倒置显微镜下对目的基因所在染色体区段进行切割与分离。显微激光切割法：将染色体标本在底部贴有特殊薄膜的培养皿上制作，利用激光共聚焦扫描显微系统，依靠高能量激光照射非选择细胞或染色体，使其受热蒸发，最后只留下目的染色体。第四节染色体介导的基因转移技术将同特定基因表达有关的染色体或染色体片段转入受体细胞，使该基因得以表达，并能在细胞分裂中一代又一代地转递下去。该技术称为染色体介导的基因转移技术，又称为染色体转导。微细胞介导的基因转移法（Microcellmediatedgenetransfer，MMGT）染色体介导的基因转移法（Chromosomemediatedgenetransfer，CMGT）微细胞介导的基因转移法微细胞是指含有一条或几条染色体，外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。微细胞制备微细胞融合微细胞的制备微细胞的融合染色体介导转移法染色体介导转移法是指分离得到相应的染色体后转入受体细胞的一种技术。染色体介导技术一般包括首先诱发细胞同步分裂，继而用秋水仙胺阻断细胞分裂于中期，再破碎细胞，通过离心收集大量的中期染色体，然后通过适当的分部或进一步的分类，即可转移到受体细胞中去。分离染色体染色体的转移受体细胞的分离与鉴定一、细胞同步化与染色体的分离二、中期染色体的转移三、导入基因的受体细胞的分离与鉴定分离：利用选择性培养基进行筛选。鉴定：染色体转移技术的应用前景染色体转移技术的应用前景第五节人工染色体染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。它需要3个关键序列，包括自主复制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）、着丝粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN)和端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）。将3个关键序列用分子生物学方法拼接起来就得到人造微小染色体（artificialminichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗以及研究染色体结构与功能关系等研究中得到了广泛的应用，具有极为重要的价值。目前，正在研究或应用的有：酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）哺乳动物人工染色体(mammalianartificialchromosome)。基于ARS、CEN、TEL是线性染色体稳定的功能序列,人们利用这些序列构建载体,重组后的DNA以线性状态存在,这样不仅稳定,而且大大提高了插入外源基因的能力,并且可以像天然染色体一样在寄主细胞中稳定复制和遗传，称为人工染色体。如利用从酵母染色体上分离的ARS、CEN、TEL序列构建载体，然后用这种载体构建的染色体即称为酵母人工染色体。酵母人工染色体的构建是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制子oriS（Shizuyaetal.1992），一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB,和parC）。