陆海滨--学生创新项目申请书

编号北京协和医学院协和青年科研基金申请书（学生创新项目）学科分类临床医学项目名称基质金属蛋白酶-14促进颗粒脂肪移植存活的实验研究项目负责人陆海滨负责人所在单位中国医学科学院整形外科医院联系电话[phone]电子邮箱[e-mail]填表日期2015年05月02日北京协和医学院科技管理处二〇一五年四月制填表说明一、本表报送一式2份。用A4复印纸，于左侧装订。二、“学科分类”选择：（1）基础医学；(2)临床医学；（3）药学；（4）公共卫生学。三、数据表中主要参加者不包含项目负责人；项目名称控制在25个字之内。四、本表须经课题负责人所在单位学术委员会审核，签署明确意见，承担信誉保证和管理职责并加盖公章。五、联系方式联系电话：[phone]邮箱：[e-mail]基本信息申请者信息姓名陆海滨性别男出生年月1986.09学号B2014004002学位博士所在科室研究中心导师信息导师姓名祁佐良职称主任医师研究方向周围神经损伤脂肪移植联系电话[phone]所在院系整形外科医院课题基本信息课题名称基质金属蛋白酶-14促进脂肪移植物存活的实验研究申请经费（万元）3.0起止年月2015年6月-2016年6月摘要（限300字）脂肪来源的间充质干细胞（ASCs）辅助颗粒脂肪移植被证实可以提高移植物的存活率，但具体作用机制仍不完善。本课题组在预实验中发现ASCs辅助的颗粒脂肪移植物中基质金属蛋白酶14（MMP14）表达增高，胶原成分发生改变。结合ASCs可以分泌MMPs促进细胞外重建以及MMP14是脂肪组织形成的关键因素两项理论依据提出假设：ASCs辅助颗粒脂肪移植后通过调节MMP14的表达促进移植物存活。为验证该假设，我们拟利用裸鼠建立ASCs辅助颗粒移植的动物模型，检测MMP-14表达、胶原沉积、血管生成相关的基因和蛋白表达，分析移植物存活情况。并直接观察MMP14抑制剂对移植物存活的影响。本研究可进一步完善ASCs促进脂肪移植存活的作用机制，并为接受MMP14抑制剂治疗患者脂肪移植时机的选择提供实验证据。关键词（用分号分开，最多5个）脂肪移植；脂肪来源的间充质干细胞；基质金属蛋白酶血管再生；胶原重构项目组成员（不包括项目申请者）序号姓名出生年月性别职称学位所在科室电话项目分工研究工作时间（月）签字1祁佐良1959.06男主任医师博士整形十六科010-88772104实验设计与指导22杨晓楠1980.01男主治医师博士整形十六科010-88772104动物实验33吕晓岩1978.07女助理研究员本科研究中心010-88772104分子生物学检测34贾振华1982.03男博士生硕士整形十六科010-88772104组织学检测35吴蓉薇1987.05女博士生硕士整形十六科010-88772104动物实验36789总人数高级中级初级博士后博士生硕士生5120020报告正文一、立项依据与研究内容1.立项依据与研究意义（800字内）脂肪移植近年来已被广泛应用于整形外科领域。但由于脂肪细胞对缺血缺氧耐受性较差，移植后大量的脂肪细胞去分化甚至死亡，使得移植物存活并不理想[1]。至今，促进颗粒脂肪移植物的存活以实现更好的填充效果，仍是值得积极探索的重要方向Yoshimura等发现，与切取的脂肪组织相比，吸脂获得的颗粒状脂肪中脂肪来源间充质细胞（Adiposederivedstemcells，ASCs）含量显著减少，由此认为在颗粒脂肪移植中补充ASCs有益于促进移植物的存活[2]，进而提出细胞辅助的自体脂肪移植技术(Cell-assistedlipotransfer，CAL)[3]：利用富含ASCs的脂肪组织基质血管成分（SVFs）与离心处理后的颗粒脂肪预混，有效提高了脂肪移植物的存活率，并提出ASCs可能是改善移植物存活的主要成分。现有研究已验证的ASCs提高移植物存活率的作用机制包括：（1）参与移植物的血运重建[2]；（2）分化为新生脂肪细胞[4]；（3）维持脂肪细胞活性[5]。但上述机制难以解释在一些研究中，无论对移植物触感、质地的评价，还是通过组织学切片中观察到的纤维结构数量，都因ASCs的加入而有所改善（图1）[6]。而我们的前期研究中也发现ASCs辅助移植后，移植物的胶原沉积存在显著差异（图4）。那么，混入的ASCs是否可以调控某种物质的表达直接影响移植物纤维成分的改变？虽然，CAL中ASCs能否直接改变移植物纤维结构的成分尚未见诸报道。但是，在一些存在纤维样改变的动物疾病模型中，局部或静脉给予间充质干细胞可以有效减少纤维样改变[7~9]。在这些研究中，ASCs减轻局部纤维样变的主要途径就是调控基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinase，MMPs）的分泌与激活，促进各类胶原成分的降解。图1不同浓度ASC辅助颗粒脂肪移植后大体和组织学观察[6]2MMPs是由多种锌离子依赖性酶组成的可降解绝大多数细胞外基质成分的重要酶类。MMPs在生理状态下低表达，在炎症、肿瘤等病理状态下呈高表达状态，促进毛细血管生成和细胞外基质的重建。而Chun等[10]发现，敲除MMP14表达基因的小鼠，脂肪组织的体积和脂肪细胞数量显著减少。后续显示，在脂肪组织形成的过程中，MMP14表达的稳定性发挥重要作用[11]。CAL后的脂肪再生，既有ASCs的辅助，也有新生脂肪形成。由此我们提出假设：CAL术后，ASCs调节MMP14的表达，通过血管再生和胶原重建，促进移植物的存活。这一研究结果着眼于颗粒脂肪移植物局部存在的胶原沉积，提出ASCs促进颗粒脂肪移植存活的新机制，并为临床工作中应用MMPs抑制剂患者接受脂肪移植时机的选择提供了初步的动物实验证据。[1]MatsumotoD,SatoK,GondaK,etal.Cell-assistedlipotransfer:supportiveuseofhumanadipose-derivedcellsforsofttissueaugmentationwithlipoinjection[J].Tissueengineering,2006,12(12):3375-3382.[2]YoshimuraK,SatoK,AoiN,etal.Cell‐AssistedLipotransferforFacialLipoatrophy:EfficacyofClinicalUseofAdipose‐DerivedStemCells[J].DermatologicSurgery,2008,34(9):1178-1185.[3]EtoH,KatoH,SugaH,etal.Thefateofadipocytesafternonvascularizedfatgrafting:evidenceofearlydeathandreplacementofadipocytes[J].Plasticandreconstructivesurgery,2012,129(5):1081-1092.[4]YoshimuraK,SugaH,EtoH.Adipose-derivedstem/progenitorcells:rolesinadiposetissueremodelingandpotentialuseforsofttissueaugmentation[J].Regenerativemedicine,2009,4(2):265-273.[5]SugaH,EtoH,ShigeuraT,etal.IFATScollections:FGF-2-inducedHGFsecretionbyadipose-derivedstromalcellsinhibitspost-injuryfibrogenesisthroughaJNK-dependentmechanism[J].StemCells,2008[6]Li,K.,F.Li,J.Li,etal.,Increasedsurvivalofhumanfreefatgraftswithvaryingdensitiesofhumanadipose-derivedstemcellsandplatelet-richplasma.JTissueEngRegenMed,2014.[7]Okura,H.,M.Soeda,M.Morita,etal.,Therapeuticpotentialofhumanadiposetissue-derivedmulti-lineageprogenitorcellsinliverfibrosis.BiochemBiophysResCommun,2014.[8]Castiglione,F.,P.Hedlund,F.VanderAa,etal.,Intratunicalinjectionofhumanadiposetissue-derivedstemcellspreventsfibrosisandisassociatedwithimprovederectilefunctioninaratmodelofPeyronie'sdisease.EurUrol,2013.63(3):p.551-60.[9]Spiekman,M.,E.Przybyt,J.A.Plantinga,etal.,Adiposetissue-derivedstromalcellsinhibitTGF-beta1-induceddifferentiationofhumandermalfibroblastsandkeloidscar-derivedfibroblastsinaparacrinefashion.PlastReconstrSurg,2014.134(4):p.699-712.[10]Chun,T.-H.etal.GeneticlinkbetweenobesityandMMP14-dependentadipogeniccollagenturnover.Diabetes59,2484–2494(2010).[11]Itoh,Y.MT1-MMP:akeyregulatorofcellmigrationintissue.IUBMBLife58,589–596(2006).2.研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题（1200字内）研究内容1）ASCs辅助颗粒脂肪移植最佳比例的筛选吸脂获得的人腹部来源的脂肪组织分做等体积的两份，制得纯化脂肪组织和ASCs,以不同比例的ASCs混合后植于裸鼠体内，以不含ASCs的常规颗粒脂肪移植组为对照。通过移植物体积、质量、Perilinpin染色对移植物存活情况进行评价，旨在筛选出ASCs辅助颗粒脂肪移植的最佳比例。2）CAL后ASCs调节MMP-14表达促进移植物存活作用的研究3在体内实验中，利用前述动物模型观察药物抑制ASCs分泌MMP14和VEGF后，在不同时间点对颗粒脂肪移植物内MMP14和VEGF表达、上游调控基因变化、胶原含量、新生血管计数及组织存活进行评价。观察MMP14表达的时间、空间变化情况，并对MMP14表达影响血管再生和胶原重建影响移植物存活的相关性进行分析。3）MMP14抑制剂减少脂肪移植物存活的作用研究在体内实验中，直接对研究内容2)中MMP14抑制组与对照组移植物存活情况进行比较分析，证实MMP14抑制剂减少脂肪移植物存活的重要作用。研究目标1）证明CAL中ASCs通过调控MMPs表达促进移植物存活2）证明MMP14抑制剂将减少脂肪移植物的存活3）初步探讨MMP14参与血管再生和胶原重构改善移植物局部脂肪细胞的存活与再生拟解决的关键科学问题1）明确分泌和激活MMP14是ASCs辅助颗粒脂肪移植后胶原沉积减少的主要原因。这是本项目首先要阐述的关键科学问题，是立题的根本。如前所述，在多种存在纤维样变的疾病中，ASCs物质通过分泌MMPs促进ECM重建的作用已经得到证实，但在CAL这一特定环境下，胶原沉积减少的主要原因是ASCs分泌MMPs促其降解，还是ASCs促进血运重建提高移植物的早期存活，减轻炎性反应