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Shiftsoffunctionalgenerepresentationinwheatrhizospheremicrobialcommunitiesunderelevatedozone译文：高臭氧浓度下小麦根际微生物群落功能基因表达的变化虽然臭氧（O3）在农业生态系统中对植物的影响力已经得到很好的研究，鲜为人知的是高浓度O3（eO3）对土壤微生物群落功能的影响。在这里，我们使用一个综合功能基因阵列(GeoChip3.0)探讨其功能性成分，和高浓度臭氧条件下，烟农19（O3-敏感）、扬麦16（O3-相对敏感）这两个普通小麦(TriticumaestivumL.)栽培品种的根际微生物群落结构。与环境臭氧(aO3)相比，eO3会导致土壤的pH值和总碳（C）在小麦籽粒和秸秆的百分比增加，并降低千粒重和土壤溶解有机碳(DOC)。基于GeoChip杂交信号强度，虽然根际微生物群落的总体功能结构没有因eO3或品种而表现出明显变化，但结果表明，参与C固定和退化，氮（N）固定，和亚硫酸盐还原特定的功能基因的丰度产生了显著的变化(P0.05)，以应对eO3和/或小麦品种的影响。同时，烟农19表现出怀有的根际微生物功能群落在响应eO3时比扬麦16更敏感。此外，典范对应分析表明，微生物群落参与碳循环的功能结构很大程度上是由土壤和植物的特性，包括pH值，DOC，微生物生物量碳C，C/N比和千粒重决定形成的。这项研究为我们理解eO3和小麦品种对土壤微生物群落的影响提供了新的见解。引言臭氧（O3）是一种大气气体，由于人类活动和工业发展，其含量一直在上升。对于农业系统而言，臭氧被认为是潜在的最严重的具有植物毒性的空气污染物，可能抑制植物生长，生产力和产量，更重要的是，它可能会极大地影响地面以下功能流程，如根系生长和碳（C）分配。预计在未来如果人为活动导致臭氧的形成继续有增无减，这种影响将更加迅速并对植物生产力，土壤碳和氮（N）的动态，以及生态系统功能产生显著影响(联合国政府间气候变化专门委员会，2007年)。小麦是世界第二大粮食作物，年产量46.5亿吨，全世界收获面积超过2亿公顷。由当地开顶式气室的研究结果和监测数据推测，1999年在中国的长江三角洲地区，臭氧污染导致小麦约10％的产量损失。目前，中国长江三角洲的平均臭氧浓度（7-10月）的范围是38到46ppb，预计到本世纪末，平均臭氧浓度将从42增加到63ppb，而根据Feng和Kobayashi的荟萃分析，这将会导致大豆、小麦和水稻的产量进一步下跌10%，菜豆产量进一步下跌20%。为减少这种O3对小麦产量负面影响的策略之一就是筛选那些更适应eO3条件的品种。最近，在中国已有一些O3-相对敏感的小麦品种的报道，这些品种可能会避免在高臭氧环境中减产。由于土壤系统依赖于植物的养分投入和土壤中微生物的养分循环，由于eO3引起的营养通量的变化也可以导致土壤微生物的生物多样性在结构和功能产生变化。近年来，大多数对根际微生物群落受eO3影响的研究主要是基于开顶式气室，结果主要侧重于微生物生物量及结构的变化，和磷脂脂肪酸分析、变性梯度凝胶电泳法，和/或单链构象多态性法等方法。这些研究表明，eO3对不同的植物/生态系统下的土壤微生物群落影响很少或显著。然而，目前研究eO3对土壤微生物的功能性进程的影响的报道很少。全面审视eO3对根际微生物群落的功能成分、结构和代谢潜力的影响是很重要的。功能基因芯片技术（例如，GeoChip）已成为一个分析不同的生态系统中微生物群落功能性成分、结构和动态的常规的分子工具。例如，GeoChip3.0是用于高浓度CO2是如何影响土壤微生物群落，结果表明，土壤微生物群落的功能性成分，结构和代谢潜力被转移，这些与土壤有机碳和氮含量及植物生产力显著相关。此外，它也应用于研究全球变暖对土壤微生物群落的影响（温度），和描述受砷污染的土壤微生物群落和被柑桔黄龙病菌感染柑橘树的根际微生物群落。所有结果表明，GeoChip是一个强大并高通量的工具来具体地，灵敏地，定量地描述微生物群落并且将它们的结构与环境因素和生态系统功能链接起来。在这项研究中，我们假设eO3带来的植物和土壤特性的变化将改变根际微生物群落的功能多样性、组成、结构和代谢潜力，而这种影响将因小麦品种而不同。为了检验这些假设，我们的目标是（i）检查eO3对烟农19（O3敏感）和扬麦16号（O3相对敏感）两个栽培品种根际微生物功能基因的影响；（ii）区分这两个品种之间是否有微分响应；及（iii）了解高浓度臭氧条件下，根际微生物群落功能结构和土壤及植物特性之间的相关性。这项研究是在一个位于中国江都市郊区的自由空气的臭氧富集？(O3-FACE)的实验站点进行。GeoChip3被用于从GeoChip杂交信号强度来确定基因丰度。虽然根际微生物群落的总体功能结构没有在eO3或品种间发生显著变化，结果表明eO3确实改变了参与C循环的功能基因的结构和参与C、N和硫(S)循环的某些关键功能基因的丰度，这或许是品种的依赖。这项研究为我们理解eO3和小麦品种对根际微生物群落的影响提供了新的见解。材料和方法现场实验和样品采集实验地点位于中国江苏省江都市城市郊区(32°35´N，119°42´E)，土壤类型为砂姜潮土（中国土壤系统分类）与沙质壤土质地，总碳量15gkg－1，总氮量1.59gkg－1，pH6.8，并且含有25.1%的粘土(0.001mm)，0–15厘米深度处的体积密度为1.2gcm－3。基于稻麦轮作制度于2007年成立了一个O3-FACE的实验平台，其中水稻在六月中旬移栽，在十月中下旬收获，冬小麦在11月初播种，在明年五月底或六月初收获。这项研究是在2010年的小麦生长季节(例如，2009年11月至2010年6月)的后三个生长季节进行的，O3熏蒸在三个时期:2007年4月14日到5月22日，2008年3月5日到5月26日和2009年3月1日至24日，他们的平均O3的浓度是环境臭氧42ppb，高浓度臭氧53.4ppb。该O3-FACE系统有三圈和三个类似环境圈。三个O3-FACE复制圈，每个直径为14.5m，被任意地设定，在2010年3月3日到5月31期间，不断提供60ppb的高浓度臭氧0900小时到1800个小时，同时三个环境（40ppb）复制圈，每个具有相同的大小，在同一区域内进行随机设置。所有的圈都足够远，以防止臭氧从一个环溢出到另一个，避免来自周围环境区域的o3-face圈的臭氧的影响。在每个O3-FACE或周围环境圈，十一月时两个冬小麦品种（烟农19和扬麦16）在每个次级圈内播种。以往的研究表明，烟农19和扬麦16对高浓度臭氧有不同的反应，烟农19（Y19）被称为臭氧敏感小麦品种，而扬麦16（Y16）则是臭氧相对敏感品种。在2010年6月10日，从6环内的2个成熟期的栽培品种中，共选取了12个根和12个的相应体积的样品。对于其进行GeoChip分析，则是在将植物从土壤中移出并甩动后，依附在植物根系的根际土壤被收集，并且每个样本组合是来自五个随机选择的植物的根，然后将其储存在－20℃的条件下直到进行DNA提取。对于土壤性质分析，从根际土壤被收集的植物的相应部位收集土样（0–15厘米深，直径2.5厘米），每个土壤样品由五个土样混合，并存储在－20℃或4℃以待进一步的分析。植物和土壤特性分析用TruSpecCN元素分析仪（LECO公司，圣若瑟，密歇根州，美国）测定植物或土壤的总碳量（TC）和总氮量（TN）。而溶解有机碳（DOC）是由综合N/C3100分析仪（耶拿分析仪器股份公司，德国耶拿）测定。土壤pH值是用玻璃电极测定1:2.5（土：水）的混合溶液（重量/体积）。将每个细班的十五个冬小麦品种收获，并划分为粮食和废弃物。二者样本在65℃干燥直至获得恒重，然后称重得到千粒重（千粒重）和个体植株的重量（植物重量）。核酸提取，纯化，扩增和标记通过冷冻粉碎法提取12个根际土壤样本的DNA。提取的DNA被存储在-80℃待用。通过ND-1000分光光度计（Nano-DropTechnologiesInc.，威尔明顿，DE，美国）评估纯化过的DNA的质量，DNA的浓度使用数量PicoGreen试剂盒（Invitrogen，卡尔斯巴德，CA，USA）和远舰的FLUOstar（BMGLABTECH，耶拿，德国）来测定。对来自每个样品的100ngDNA的等分试样，使用TempliPhi试剂盒（AmershamBiosciences公司，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国）在一个修改过的含有用于提高扩增的灵敏度的单链结合蛋白(200ngμl－1)和亚精胺(0.04mM)的缓冲区，在30℃以一式三份扩增3小时。扩增的DNA（〜3.0毫克）与20毫升2.5×随机引物（Invitrogen）中，加热至99℃并保持5分钟，然后立即置于冰上，接下来荧光标记在含有50μM的dATP，dCTP，三磷酸，20μM的dTTP（USB公司，克利夫兰，OH，USA），1mM的Cy5标记的dUTP（Pharmacia公司，新泽西州Piscataway，USA）和Klenow片段40U（Invitrogen公司），在37℃培养3小时。该标签的产品均用QIAquickPCR纯化试剂盒（Qiagen，瓦伦西亚，CA，USA）纯化，然后在SpeedVac（赛默飞世尔科技公司，米尔福德，MA，USA）45℃温度条件下干燥45分钟。基因芯片杂交，扫描和阵列数据处理荧光标记的DNA悬浮在杂交组合（50％甲酰胺，3×SSC，0.3％SDS，0.7mgml-1鲱鱼精子DNA），和0.86mMDTT在95℃孵育5分钟，然后温度保持在60℃至杂交。样品通过GeoChip3.0在MAUI杂交系统（BioMicro系统，盐湖城，UT，USA）进行杂交，保持在42℃12小时。用一个ProScanArray微阵列扫描仪（Perkin-Elmer公司，波士顿，MA，USA）对微阵列进行扫描，用ImaGene6.0（生物发现，埃尔塞贡多，CA，USA）对每个点的信号强度进行测量。空余和表现差的点在信号强度被下滑的信号归一化之前被移除，信号噪声比（SNR=（信号均值的背景均值）/背景的标准偏差）2.0的点被用作积极截止点进行进一步的分析。如果一个基因是在至少2个12个样品被检测出则被认为是积极的。统计分析所有的数据都通过对裂区设计的一般线性模型分析来确定O3浓度（环境浓度与高浓度水平）、不同的小麦品种（Y19与Y16）的影响和它们之间的相互作用。如前所述，分别计算其多样性指数。置换多元方差分析（Adonis）是基于欧几里德距离矩阵，通过排列（999倍）区分处理间差异的不同，这一有意义的测试是基于伪-F的比率。曼特尔和部分曼特尔分析被用来关联微生物群落的功能结构和植物及土壤变量。所有的统计分析采用theVeganpackageinR？。趋势对应分析（DCA）和典范对应分析（CCA）使用适于Windows4.5版本的CANOCO。结果eO3对土壤和植物特性的影响为了解eO3是否会影响土壤和小麦特性，对5个土壤变量和10个植物变量进行了测量（补充表S1）。方差分析结果表明，在高浓度臭氧条件下，土壤pH值、谷物(TC-grain)和秸秆(TC-straw)的总碳量均显著（P0.05）增加，而DOC和千粒重均显著（P0.05）降低。此外，DOC和粒重的下降在烟农19和扬麦16号品种之间存在显著（P0.05）的差异，其中扬麦16号品种平均减少17.4%，而烟农19则平均减少15.4%（图1）。然而，在高浓度臭氧条件下，微生物生物量碳（MBC），总碳量，总氮量，C/N比（CNR），谷物（TN-grain）和秸秆（TN秸秆）总氮，谷物和秸秆碳氮比（CNR-grain，CNR-straw），穗长，单株重和根-秸秆的重量没有明显变化（补充表S1）。此外，没有观察到臭氧与品种的相互作用的显著影响（补充表S1；图1）。土壤和植物特性的这些变化可能会影响根际微生物群落功能性成分及结构，本研究将通过GeoChip3对其进一步探讨。全面评价eO3