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实验十三～十四医院感染的微生物监测及细菌计数一、实验目的1．掌握医院感染微生物监测常用培养基的配制。2．掌握高压蒸汽灭菌器使用及灭菌效果的监测方法。3．掌握空气、物表、手、使用中消毒液及无菌物品的监测方法。4．掌握紫外线杀菌效果的监测方法。二、实验材料1．试剂蛋白胨、牛肉膏（粉）、氯化钠、琼脂、蒸馏水、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、硫代硫酸钠、卵磷脂、甘氨酸、吐温-80、10%NaOH、1NHCl、4%酚红等。2．材料三角烧瓶、量筒、精密pH试纸、天平、高压蒸气灭菌器、无菌试管、无菌平皿、加样器、加样头、电炉、枯草杆菌黑色变种芽胞ATCC9372）等。三、实验方法（一）常用培养基的配制1.普通营养琼脂平板配2000ml成分：蛋白胨10g、牛肉膏（粉）5g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.2～7.4。上述各成份混合、溶解，校正pH。121℃20min灭菌后，备用。2.营养肉汤配500ml成分：蛋白胨10g、牛肉膏（粉）5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml、pH7.2～7.4。上述各成份混合、溶解，校正pH，分装每管4～5ml，121℃20min灭菌后，备用。3．中和剂配制配500ml成份：无水磷酸氢二钠2.83g、磷酸二氢钾1.36g、胰蛋白胨10g、牛肉粉3g、葡萄糖2g、硫代硫酸钠5g、卵磷脂3g、甘氨酸3g、吐温-8030ml。将各成分加入到1L蒸馏水中，待完全溶解后，加0.4%酚红4ml，调PH至7.2～7.4（淡红色），分装每管4ml，121℃20min灭菌后，备用。4．无菌盐水：0.9%NaCI分装每管5ml，121℃20min灭菌后，备用。（二）高压蒸汽灭菌器的使用原理在密闭的条件下，蒸汽不能外泄，使灭菌锅内压力增高，随之蒸汽温度也增高。高温蒸汽有很强的穿透性，热传导快，使被灭菌物品内温度迅速上升，同时含水多的环境下蛋白质较易凝固，通过凝固菌体蛋白而达到灭菌的目的。设备构造高压蒸汽灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水。外层坚厚，其上方有金属厚盖，锅沿旁有螺栓，借以将锅盖紧闭，使锅内气体不能外溢，因而蒸汽压力升高，从而水蒸气的温度也相应地升高。高压蒸汽灭菌器上装有排气阀计可以显示内部的蒸汽压力和温度、安全活塞以调节蒸汽。其种类有手提式、直立式、横卧式等。它们的构造及灭菌原理基本相同。高压蒸汽灭菌锅压力与温度的关系见下表。压力温度（℃）Kg/cm2磅0.3551080.70101161.05151211.4020127现在最常用的培养基灭菌条件是1.05kg／cm2(121℃)20min，时间过长有可能破坏培养基的营养成分。含糖的生化培养基的灭菌条件是0.7kg／cm2(116℃)15min，或用流动蒸汽法灭菌。器皿的灭菌可以1.05kg／cm220min。操作方法：1．将欲灭菌物品放入锅内，关闭锅门，拧紧螺丝。确认已经密闭，方可进入下—步操作。2．关闭排气阀、排水阀，打开进水阀（补足水位）。3．打开电源，加热，使产生蒸汽。4．当压力表指针指达34kPa(5磅/英寸2，108℃）时，打开排气阀，排出锅内冷气。5．待锅内冷气排尽后，关闭排气阀。观察压力表升至1.05kg／cm2（121℃）时，开始记时。持续20min，至多不能超过30min，否则营养物受破坏。7．切断电源，让锅内物品自然冷却，不可马上打开排气阀，以免发生意外。8．待锅内压力降为零时，才可打开锅门，取出物品。注意事项：1．内热式高压灭菌锅，在通电前一定要补足锅内水位，否则加热时会烧毁加热管。2．排气时，必须待锅内冷气完全排出后才可关闭排气阀加压，否则达不到灭菌效果。3．每周必需定期用留点温度计或嗜热脂肪芽胞杆菌监测灭菌效果。（三）蒸汽高压锅灭菌效果监测生物监测方法：将含有5×105～5×106cfu嗜热脂肪芽胞杆菌（ATCC7953）的溴甲酚紫蛋白胨水管分3点或5点与待灭菌物品一并放入容器内。经121℃20min灭菌后取出放入56℃～60℃温箱内培养7天，同时放一支未灭菌的指示管作阳性对照，若指示管颜色变黄或混浊即未达到灭菌效果，若培养基颜色不变或澄清则灭菌效果合格（四）空气采样及检查方法1．采样时间：选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。2．采样高度：与地面垂直高度80～150cm。3．布点方法：室内面积≤30m2，设一条对角线是取3点，即中心一点。两端各距墙1m处各一点；室内面积＞30m2，设东、南、西、北、中5点，其中东、南、西、北点均距墙1m。4．采样及培养方法：用9cm直径的普通营养琼脂平板在采样点暴露5分钟后送检培养。35℃24h培养检测。5．结果计算：前苏联细菌学家奥梅杨斯基认为：在面积100cm2的培养基表面，5min内沉降的细菌数约和10L空气中含的细菌一样多。其计算公式如下：空气细菌菌落总数(cfu/m3)＝5000NAT式中：A为平板面积（cm2）；T为平板暴露时间（min）；N为平板平均菌落数（cfu/平皿）6．结果：Ⅰ类环境应≤10cfu/m3;Ⅱ类环境应≤200cfu/m3;Ⅲ类及Ⅳ类环境≤500cfu/m3。7．临床意义：不得检出致病性微生物，在可凝污染情况下进行相应指标的检测。（五）物体表面采样及检查方法1．采样时间：选择消毒处理后4小时内即工作状态下进行采样。2．采样面积：被采样表面＜100cm2，取全部表面；被采样表面≥100cm2，取100cm2。3．采样方法：采用棉拭子采样法，用5×5cm2的标准灭菌规格板放在被检物体表面，用浸有无菌生理盐水的棉拭子1支，在规格板内横竖往返各涂5次，并随之转动棉拭子连续采样1～4个规格面积，剪去手接触部分，将棉拭子放入装有5ml采样液的试管中送检。门把手、水笼头等小型物体则用棉拭子直接涂抹物体的方法采样。4．检验方法：将采样管震打80次，混匀后取0.5ml采样液倒入直径9cm的无菌平板中，再用倾碟法倾入25ml的营养琼脂，冷却，35℃培育24h.5．结果计算：物体表面细菌菌落总数（cfu/cm2）＝平板上菌落的平均数×采样液稀释倍数采样面积（cm2）6．结果：Ⅰ类及Ⅱ类环境≤5cfu/m2;Ⅲ类环境≤10cfu/m2；Ⅳ类环境≤15cfu/m2。7．临床意义：致病性微生物如A群溶血性链球菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌不得检出。在疑为污染的情况下可进行流行病学的预防及追踪调查。（六）医护人员手采样及检查方法1．采样时间：在接触病人，从事医疗活动前进行采样。2．采样面积及方法：被检者五指并拢，将浸有无菌生理盐水的棉拭子一支在双手指曲面从指根端来回涂擦两次，一只手涂擦面积约30cm2，并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子放入装有5ml采样液的试管内送检。采样面积单位为cm2。3．细菌菌落总数检查：取0.5ml采样液和25ml的营养琼脂倾入直径为9CM的无菌平板中，混匀、冷却。置35℃、24h培，再进行菌落计数。4．结果计算：细菌菌落总数（cfu/cm2）＝平板上菌落的平均数×采样液稀释倍数/30×2。5．结果：I类及II类环境的医护人员手指的菌落总数＜＝5cfu/cm2；III类环境的医护人员手指的菌落总数≤10cfu/cm2；IV类环境的医护人员的菌落总数≤15cfu/cm2。6．临床意义：对于致病性微生物如A群链球菌、金黄色葡萄球菌球菌、沙门氏菌等一个都不允许。对潜在和发生医院感染的流行菌株进行追踪调查，控制感染。（七）使用中消毒与无菌器械保存液采样及检查方法1．采样时间：采取更换前使用中的消毒剂与无菌器械保存液2．采样量及方法：目前常用稀释中和法，在无菌条件下，用无菌吸管吸取1ml被检样液，加4ml中和剂中混匀。然后吸取0.5ml滴于干燥普通琼脂平板，每份样品同时做2个平行样。一个板置20℃培养7天，观察细菌生长情况，另一平板置35℃培养72小时，若疑有致病菌则分离鉴定。3．计算方法：消毒液染菌量（cfu/ml）=每个平板上的菌落数×104．结果：消毒液染菌量≤100cfu/ml，并未检出致病菌为合格。无菌器械保存液无菌生长。5．注意事项：采样后1h内送检。对于含氯、碘。过氧化物消毒剂，中和剂中硫代硫酸钠浓度为0.1%；对于洗泌太、季铵盐类消毒剂，中和剂中吐温80（w/v）浓度为3%，卵磷脂浓度为0.3%；对于醛类消毒剂，中和剂中甘氨酸的浓度为0.3%。（八）紫外线杀菌效果监测原理：紫外线是日光中的主要的杀菌因素。波长为200-300nm的紫外线均具有杀菌作用，其中波长为265-266nm的紫外线最易被细菌的核酸吸收，从而改变细菌的生物学活性，导致细菌的变性、死亡。有人认为经紫外线照射后，可使DNA的胸腺嚓咤形成二聚体，从而干扰了DNA的复制，发挥杀菌的作用。医学上常用特制的紫外线灯进行空气、物品表面等的消毒。检测方法：1.取无菌试管一支，加大约2ml无菌盐水，挑枯草杆菌黑色变种芽胞ATCC937研匀成0.5麦氏浓度，再做好1/10、1/100、1/1000稀释。2.将上述稀释好的菌液（3个稀释度）各取100µl，加入无菌平皿内（每个稀释度做3个平皿）并水平摇动，使均匀散开。3.开启紫外灯5min后，将加菌的平皿（每个稀释度做2个，1个用做对照）开启平皿盖一半，距离紫外线灯管1米以内，分别接受紫外线照射30min，1h。4.于不同照射时间取出平板，加0.5ml无菌盐水充分摇动，使均匀散开。加入冷至55℃的营养琼脂倾25ml，混匀、冷却。置35℃、培养24h，进行菌落计数（未接受紫外线照射的平皿以同法处理做阳性对照）。4．计算杀灭率：杀灭率＝阳性对照回收菌数－试验组回收菌数×100%阳性对照回收菌数5．结果判断：指示菌杀灭率＞99.9%判为消毒合格。6．临床意义：适用于紫外线直接照射到的物体表面消毒效果评价。注意事项：由于紫外线的穿透力较弱，所以进行消毒时要注意：①紫外线光源与被消毒物体之间不能有任何的阻隔，甚至是玻璃、纸张也会阻挡紫外线；②紫外线光源与被消毒物品之间的距离应在1米以内；③消毒的时间要足够；④由于紫外线也可以破坏人体细胞的DNA，所以实验者不能长时间暴露于紫外光源下，避免皮肤和眼睛损伤。思考题1．怎么进行空气的细菌学监测？2．高压灭菌最常用温度是多少？有什么意注事项？