高锐—基因敲除技术在微生物代谢工程方面的应用

兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述题目：基因敲除技术在微生物代谢工程方面的应用作者：高锐学号：201207724指导教师：谢放完成日期：2014-7-161基因敲除技术在微生物代谢工程方面的应用高锐201207724摘要：基因敲除技术在微生物代谢工程上的应用渐趋成熟，本文在此基础上先对基因敲除技术及代谢工程的相关概念做了简要介绍，然后以阻断细胞的代谢旁路和引入突变位点这两条途径来着重介绍基因敲除技术在微生物代谢工程上的具体应用，最后说明了基因敲除技术应用于微生物代谢工程的一些技术缺陷。旨在对应用于微生物代谢工程的基因敲除技术做一个概括而全面的介绍与描述以及未来的展望。关键词：基因敲除技术微生物代谢工程1.前言基因敲除是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,利用微生物体内的同源重组系统,在一定选择压力下使体外改造的某功能基因与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重组,从而改变细胞的遗传特性。利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路,或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量,从而达到微生物育种的目的[1]。微生物种类繁多,数量庞大,是大自然提供的天然宝藏。随着科技的发展,发酵工业与生物催化向人们提出了更高的要求,进一步提高目的产物的产量、纯度及开发有价值新化合物等都是有待解决的问题,因此微生物应用的难题集中到如何对菌种进行改造,以获得高产高效的工业菌株[2]。随着对微生物代谢机理认识的不断加深,随着生物化学、细胞生物学、应用分子生物学、遗传工程的发展,定向操纵遗传变化成为可能,代谢工程应运而生。代谢工程就是利用重组DNA及其他技术,有目的地改变生物中已有的代谢和表达调控网络,以更好地理解细胞的代谢途径,并用于化学转化、能量转移及大分子装配过程。对于工业微生物育种来说,从野生出发菌株到高效生产菌株,需要经过代谢分析—设计策略—遗传修饰—代谢分析这一流程,不断的循环调整,对宿主进行遗传修饰为其中的重要一环,包括DNAshuffling,genomeshuffling及基因敲除技术,这些DNA重组手段可以快速改变分散在基因组不同位置上的一个或数个基因,从而改变相应的细胞表型,快速优化代谢途径,极大地促进代谢工程的进一步发展和应用[3]。22.1.基因敲除技术在微生物代谢工程方面的应用应用基因工程技术对微生物细胞内的代谢通量进行重新设计,是获得高产高效的工业菌株的重要手段之一。利用基因敲除技术在微生物代谢工程方面的应用主要包括两种途径：一是通过阻断细胞的代谢旁路的方法来提高代谢产量；二是通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量而达到调节代谢流,改进微生物代谢产物产量，从而达到优化代谢途径的目的。下面分别介绍这两种方法[4]。2.1.1.利用基因敲除技术阻断旁路代谢产物的产生（一）提高维生素产量维生素C是人体必需的一种维生素和抗氧化剂，2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）作为维生素C的前体物质，它的生物合成一直受到人们重视[5]。人们采用欧文氏菌和棒状杆菌进行串联发酵产生2-KLG时，菌株具有很高的2-酮基醛糖还原酶（2-KR）活力，2-KR能够利用NADPH或NADH辅酶将工程菌代谢中重要的中间产物2，5-DKG及终产物2-KLG转化为副产物5-酮基-D-葡萄糖酸（5-KDG）和L-艾杜糖酸（L-IA），阻碍2-KLG的发酵生产[6]。构建了基因敲除质粒利用同源重组的方法用体外突变失活的2-KR基因替换基因组上正常的2-KR基因，采用抗性标记进行初筛，并用四环素抗性菌体对萎蔫酸等脂类螯合剂高度敏感进行四环素抗性丢失的正向筛选[7]。构建葡萄糖一步发酵产生2-KLG的基因工程菌，将为阻断旁路代谢，实现从葡萄糖一步发酵产生维生素c前体2-酮基古龙酸（2-KLG）打下基础[8]。（二）提高苏氨酸产量L-苏氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，在食品、医药等方面有极其重要的用途。应用质粒pKD46介导的Red同源重组技术敲除大肠杆菌ITHR中L-苏氨酸合成的代谢旁路途径中编码高丝氨酸转酰基酶的metA基因和编码苏氨酸脱氢酶的ilvA基因，分别构建了单敲除突变菌和双敲除突变菌[9]。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065分别转入这些突变株中，构建了L-苏氨酸基因工程菌，进行连续发酵培养，当metA和ilvA基因同时敲除，苏氨酸的产量达到13.6±1。14g/L，增加了约1.45倍。证明同时阻断蛋氨酸和异亮氨酸合成途径，更能够增加L-苏氨酸的积累10]。（三）提高色氨酸产量L-色氨酸作为必需氨基酸已广泛应用于医药、食品等工业。常用重组大肠杆菌作为生产菌株，在葡萄糖为碳源的培养过程中会积累大量乙酸，从而抑制菌体生长，并降低外源基因表达效率[11]。通过敲除pta基因，阻断大肠杆菌培养过程中乙酸产生的主要通路，降低其累积水平，提高L-色氨酸产量，最终菌体生物量和L-色氨酸产量分别提高了52.7%和46.8%[12]。32.1.2.利用基因敲除技术引入突变位点改变目的产物的产量或质量（一）提高葡萄糖产量葡萄糖是大多数原核生物优先利用的碳源，其分解代谢物对许多基因的表达产生阻遏或激活作用，引起复杂的生理效应，这种现象称为碳分解代谢物阻遏效应（CCR效应）。CCR效应的存在影响枯草芽孢杆菌（B.subtilis）对葡萄糖的利用，抑制菌体生长，降低B.subtilis生产发酵核黄素的效率[13]。应明等采用基因重组技术敲除了核黄素发酵菌株中介导CCR全局调控因子的ccpA基因，缓解了葡萄糖所引起的CCR效应，提高了菌株对葡萄糖的耐受力，显著提高菌株的核黄素发酵产量，当葡萄糖浓度为10%时，重组菌核黄素产量比出发菌株提高了95%[14]。（二）提高乙醇产量乙醇和丁醇不仅是重要的有机化工原料，还是一种极具潜力的新型生物燃料。在酿酒酵母中，乙醇脱氢酶Ⅱ（adh2）在发酵过程中执行催化乙醇生成乙醛的生物学功能，乙醛脱氢酶Ⅵ（ald6）可以将乙醛转化为乙酸[15]。王艳尊等利用应用重组DNA基因敲除技术成功构建了adh2基因缺陷型突变株，在酿酒酵母adh2基因缺失基础上，应用长侧翼同源两步PCR（LFH-PCR）策略构建ald6基因敲除组件，进一步改造酿酒酵母细胞内乙醇代谢途径，增强酿酒酵母乙醇合成代谢活性，提高乙醇产量，结果显示突变株比出发菌株乙醇产量提高了12.5%，且乙酸产量较出发菌株降低了18%[16]。（三）提高丁醇产量3-磷酸甘油酯酶是酿酒酵母乙醇代谢支路即甘油代谢上的一个关键酶，其催化从3-磷酸甘油到甘油的反应[17]。通过设计含有与hor2（gpp2）基因两侧序列同源的长引物，以质粒PUG6为模板进行PCR构建含有Cre/loxP系统的酿酒酵母hor2基因敲除组件，敲除hor2基因，阻断或部分阻断甘油代谢路径，获得了突变株，使更多的碳源转化为乙醇，突变株甘油产量降低了3.34%，乙醇产量提高1.96%，从而增强酵母产乙醇的能力[18]。通过非复制性质粒，对乙酰乙酸脱羧酶aad基因进行阻断试验，发现丁醇合成显著下降，转化子经过25次传代，此性状稳定存在，证实了aad基因在丁醇合成中起着重要作用。而其进一步的研究发现，敲除磷酸转乙酰酶基因pta或丁酸激酶基因buk，丁酸合成会减少，而丁醇产量明显提高[19]。2.2.基因敲除技术应用于微生物代谢工程的技术缺陷随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包4括：一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能[20]；另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的死亡，也就无法对这些必需基因进行相应的研究[21]。其具体表现为：(1)在敲除过程中，被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区，残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能，这将给表型分析带来麻烦[22]；(2)敲除掉某个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因在于许多基因在功能上是冗余的，敲除掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其它成员可以提供同样的功能[23]；(3)对于某些必需基因，敲除后会造成细胞死亡，也就无法研究这些必需基因的功能[24]；(4)实验费用偏高，同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除获得的表型差异很大[25]。3.总结基因敲除技术从20世纪70年代发展至今，在很多领域已经占据了其他技术不能取代的地位，作为一项新兴的微生物育种技术,基因敲除克服了传统诱变方法的盲目性和偶然性,敲除后被改变的基因会随染色体DNA进行复制,改良的菌种可稳定地用于后续的研究和生产[26]。而随着大量模式生物及重要功能微生物全基因组的解明以及功能基因的定位,人们从基因水平上更加清楚的认识微生物代谢的规律,同时敲除载体及相关技术的完善可进一步推动代谢工程的广泛应用,通过基因敲除手段改变微生物细胞的代谢流向,阻断有害代谢产物积累,可望降低成本,大幅度提高生产水平及产品纯度[27]。由此可见，基因敲除技术在微生物代谢工程上具有广阔的发展前景以及巨大的开发潜力以及丰富的应用价值。4.参考文献[1]王晓敏，侯占铭。“基因敲除”技术的研究与应用[J]。考试周刊。2014年，87[2]刘翠花。应用基因敲除快速构建大肠杆菌突变体改造脂肪酸代谢途径[J]。微生物学报，2013年，65[3]李燕等。发酵工业菌种改良中的基因敲除策略及应用[J]。中国酿造，2013年，1[4]王文文登。利用基因敲除技术缺失毕赤酵母羧肽酶Y基因的初步研究[J]。军事医学，2014年，9[5]胡逢雪等。大肠杆菌基因无痕敲除技术及策略[J]。生物技术通讯，2013年，4[6]肖水华等。基因敲除技术在芽胞杆菌中的应用研究[J]。生物技术进展，2013年，2[7]吴伟斌等。大肠杆菌ptsG基因的敲除及其对L—phe生产的影响[J]。氨基酸和生物资源，2012年，2[8]黄钦耿等。基因敲除策略在氨基酸产生菌代谢工程中的应用[J]。发酵科技通讯，2013年，2[9]宋安东等。基因敲除在工业微生物育种方面的应用[J]。生物学杂志，2014年，6[10]张红岩等。基因敲除技术及其在微生物育种中的应用[J]。酿酒科技，2014年，4[11]李樊等。基因敲除技术研究进展[J]。生物技术通报，2013年，2[12]陈健铭等。几种常用的基因敲除技术[J]。武夷科学，2014年，1[13]谢承佳等。基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用[J]。生物加工过程，2013年，3[14]刘建忠等。基因敲除技术研究进展[J]。化学与生物工程，2013年，2[15]陈功星,董庆华,张佳炜等。特异小干扰RNA敲除PLK1基因的表达[J]。遗传。2013,28(1)：21-25。[16]范钰,张尤历,张宇川等。siRNA敲除STAT3基因对结肠癌HCT116细胞侵袭的抑制[J]。江苏大学学报(医学版),2012,17(1)：46-48。[17]褚晓红,杨公社,郑新民。基因打靶技术及其影响因素［J］。黄牛杂志。2013,(05)。[18]侯昭晖，杨仕明，杨伟炎条件基因敲除技术及应用现状[J]。国际遗传学杂志，2014，30（1）：19-24。[19]宋浩雷，郭晓贤，杨月梅等。酿酒酵母ADH3基因的敲除[J]。工业微生物，2014，36（4）：28-32。[20]张红岩，申乃坤，周兴。基因敲除技术及其在微生物育种中的应用[J]。酿酒科技，2013，4：21-25。[21]李湘萍，徐慰倬，李宁。动物基因敲除研究的现状与展望[J]。遗传，2014，25（1）：81-88。[22]史文慧，林会兰，孙智杰等。用PCR产物直接的基因转化获得酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因突变的单倍体[J]。生物学杂志，2013，18（5）：18-20。[23]刘德培,方福德,梁植权。生理科学进展,2013,26:909-9131。[24]唐雪明,邵蔚蓝,沈微等。生物技术,2012,12(4):1