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鱼类生理学实验实验一反射中枢活动的某些基本特征及反射弧的分析实验项目学时：3**实验要求：■必修□选修一、实验目的及要求：通过对某些脊髓反射（如脊蛙的屈肌反射）的分析，了解反射弧完整性与反射活动的关系。掌握反射时的测定方法，通过用不同浓度的硫酸溶液刺激蛙趾引起屈肌反射。以脊蛙的屈肌反射为指标，观察反射中枢活动的某些基本特征，并分析它们产生的机制。二、实验基本原理：在中枢神经系统的参与下，机体对刺激所产生的具有适应意义的规性律性反应过程称为反射。将动物的高位中枢切除仅保留脊髓的动物成为脊髓动物（如脊蛙），它们产生的反射活动为单纯的脊髓反射，由于失去高位中枢的控制反射活动较为简单，便与观察与分析反射过程的某些特征。反射活动的结构基础是反射弧。典型的反射弧由感受器、传入神经、神经中枢、传出神经和效应器五个部分组成。反射弧必须保持完整性，才能引起反射，其中任何一个环节受到破坏，反射活动就无法实现。在反射活动中，由于神经元特别是中间神经元联系方式的不同，使反射活动表现出种种特征。如：反射时（从刺激作用于感受器至效应器出现反应所经历的时间）的长短、反射活动空间范围的大小、反射活动持续时间的久暂以及引起反射活动的刺激条件等等。三、主要仪器设备及实验耗材：蟾蜍、硫酸溶液（0.1%,0.3%,0.5%,1%）、纱布。蛙类手术器械、铁架台、血管钳一把、秒表、玻璃平皿、肌夹、搪瓷杯、小滤纸（约1cm×1cm）、烧杯。四、实验内容或步骤：1、实验准备取蟾蜍一只，用粗剪刀由两侧口裂剪去上方头颅，制成脊蟾蜍。将动物俯卧位固定在蛙板上，于右侧大腿背侧纵行剪开皮肤，在股二头肌和半膜肌之间的沟内找到坐骨神经干，在神经干下穿一条细线备用。手术完后，用肌夹夹住动物下颌，悬挂在铁架台上。2、实验项目（l）反射中枢活动的某些基本特征①反射时的测定：在平皿内盛适量0.1%硫酸溶液，将蟾蜍一侧后肢的一个脚趾尖浸入硫酸溶液中，同时按动秒表记录从浸入时起至后肢发生屈曲所需要的时间，并立即将该足趾浸入搪瓷杯水中浸洗数次，然后用纱布拭干。用上述方法重复三次，注意每次浸入趾尖的深度要一致。三次所测时间的平均值，即为此反射的反射时（两次实验间隔至少2～3min）。然后平皿中分别换以0.3%、0.5%、1%的硫酸溶液再重复上述测定，比较四种浓度硫酸所测之反射时是否相同。（2）反射弧的分析①用浸有1%硫酸溶液的小滤纸片贴在下腹部。观察双后肢有何反应？待反应出现后，将动物浸于搪瓷杯的清水内洗掉滤纸片和硫酸，用纱布擦干皮肤。提起穿在右侧坐骨神经下的细线，剪断坐骨神经，再重复上述实验，比较两次结果有何不同？②分别将左右后肢趾尖浸入盛有1%硫酸的小平皿内（两侧浸没的范围相等且仅限于趾尖），双侧后肢是否都发生反应？③沿左后肢趾关节上做一环形皮肤切口，将切口以下的皮肤全部剥脱（趾尖皮肤一定要剥干净），再用1%硫酸溶液浸泡该趾尖（切不可将其他趾尖浸入），观察该侧后肢的反应。④将一1%硫酸纸片贴于左后肢皮肤，观察引起的反应，用搪瓷杯中清水洗掉纸片及硫酸，擦干皮肤后，将探针插入脊髓腔内反复捣毁脊髓，再重复刚才的实验。结果如何？[方法评估]操作简单、易于掌握，为常规实验方法。[应用意义]为了解中枢神经系统某些特征及活动规律的验证性实验，主要用于观察分析中枢神经系统内反射中枢的活动规律及反射弧的完整与反射活动的关系。[注意事项]1、离断颅脑部位要适当，太高可能保留部分脑组织而出现自主活动，太低也会影响反射的引出。2、每次用硫酸溶液或纸片处理后，应迅速用搪瓷杯中的清水洗去皮肤上残存的硫酸，并用纱布擦干，以保护皮肤并防止冲淡硫酸溶液。测定反射时的硫酸浓度应由低到高。3、浸入硫酸溶液的趾尖应仅限于一个，而且每次浸泡的范围也应恒定，切勿浸入太多。五、思考题1、何谓反射时，反射时与刺激强度之间有何关系？2、反射弧包括哪几部分？剥去趾关节以下的皮肤后不再出现原有的反射活动，为什么？实验二鱼类血液红细胞和白细胞的计数实验项目学时：3**实验要求：■必修□选修附件一鱼类红细胞与白细胞的计数（必修）[目的与原理]掌握鱼类采血技术和鱼类红、白细胞计数的原理和方法，并测定不同鱼类的红、白细胞含量及其差异。采用稀释法计数鱼类单位容积血液内的红细胞和白细胞数。由于血液中红、白血细胞数很多无法直接计数，故需用适当的溶液将血液稀释。然后将稀释血滴入血细胞计数板上，在显微镜下计数一定容积的红、白细胞数。再将所得的结果换算为每立方mm血液中红、白细胞个数。[实验对象]鲤、鲫或草鱼。[试剂与器材]显微镜，血细胞计数板，计数器，鱼用注射器（1ml或5ml），吸血管，凹瓷盘，消毒棉球，纱布，擦镜纸，小试管及试管架，移液管（1ml及2ml），红、白细胞稀释液（或0.85—0.9%的NaCl溶液），75%的酒精，蒸馏水，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。[实验步骤]1、熟悉血细胞计数板的构造：血细胞计数板为一长方形厚玻璃板。其中计数室方格大小的划分，各种产品略有不同，但基本原理相同。其中央横沟的两边各有一计数室，两计数室的划分完全相同（图1-5-1）。在显微镜低倍下观察，可见每个计数室用双线划分成9个大方格（图1-5-2）。大方格每边长1.0mm。四角的大方格每个又分为16个中方格，这是用以计数白细胞的。中央的一个大方格用双线分成25个中方格，每个中方格又等分成16个小方格（用单线），中方格每边长为0.2mm，计数红细胞时，数中央大方格的5个中方格（即四角和中央的中方格）内的红细胞数目（图1-5-2）。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1mm，因此，放上盖玻片后，计数板与盖玻片之间的距离为0.1mm，此为计数室的高度。2、采血及稀释：以2ml移液管在干净的小试管内准确加入红细胞稀释液或0.85~0.9%的NaCl溶液2ml，另用1ml移液管在另一干净的小试管内加入白细胞稀释液0.38ml，备用。鱼类血液可从心脏或尾动脉中采取。方法是将鱼腹部向上固定在鱼解剖台上，或用纱布包好握在手里，用浸润过抗凝剂的注射器沿鱼体中线与两腹鳍根部之间相交部位刺入，依据解剖部位确认已刺入心脏，可稍后拔针管，如有血液吸入即可，否则重新拔出再刺。图1-5-1血细胞计数室结构图1-5-2血细胞计数区尾动脉取血方法是用注射器从鱼体臀鳍后部插入至椎体腹侧，尾静脉血液顺势流入针管，每尾鱼可用此方法数次采血，但每次针头插入部位应在前次插入之前。将抽出的血液放入经抗凝剂处理的凹瓷盘内，用微量（血红蛋白）吸血管吸取10μl血液至红细胞稀释液试管内，再吸取20μl血液至白细胞稀释液试管内，轻轻挤出血液并反复吸洗2～3次。然后将血液与稀释液混和均匀，但不可用力振荡，以免细胞破碎。3、充液：将盖玻片先盖在计数板上，用洁净的吸血管吸取摇匀的稀释血液，然后将吸管口轻轻斜置盖玻片的边缘，滴出少量稀释血液，使溶液借毛细管现象而流入计数室内。但必须注意，如滴入过多时，流出室外凹沟中，易造成盖玻片浮起，体积不准；过少时，经多次充液，易造成气泡，所以都应洗去重新充液。4、计数：稀释血液滴入计数室后，须静置2—3分钟，然后低倍镜下计数（显微镜焦距准确，缩小光圈并降低聚光器。使视野较暗）。计数白细胞时，数四角四个大方格内的白细胞总数。计数红细胞时数中央大方格四角的四个中方格和中央的一个中方格（共5个中方格）内的红细胞总数，计数时应循一定的路径以免遗漏或重复。对于分布在划线上的血细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数（图1-5-3）。计数白细胞时，如发现每个大方格白细胞数相差10个以上；计数红细胞时，如发现各个中格之间的红细胞数相差超过15个，表示血细胞分布不均匀。应将计数板洗净，重新摇匀稀释血液，再充液计数。5．计算红细胞数目：将5个中方格内数得的红细胞总数乘以10，000．即得每立方mm血液中红细胞总数。图1-5-3血细胞计数方式（实心圈表示计数的红细胞，空心圈表示不应计数的红细胞）计算公式为：红细胞数/mm3=5个中格红细胞数×稀释倍数/计数的5个中格容积（1）稀释倍数等于稀释液2ml除以加入血10μL（0.01ml），为200倍。（2）计数室5个中格容积为0.2×0.2×0.1×5=0.02mm3。白细胞数目：将4个大方格内数得白细胞总数乘以50，即每立方mm血液的白细胞总数。计算公式为：白细胞数/mm3=4个大方格白细胞数×稀释倍数/计数的4个大格容积（1）稀释倍数等于稀释液0.38ml+血20μL（0.02ml）/0.02ml，为20倍。（2）计数室4个大方格容积为1×1×0.1×4=0.4mm3。[方法评估]采用显微镜目视计数法为血液红、白细胞数量测定的最常用的基本方法，目前虽有各种自动化分析方法，但该方法由于经典、方便、实用，仍较广泛用于血液检验和科研实践中。[应用意义]红细胞是血液中数量最多的有形成分，在正常情况下几乎占血容量的1／2，故使血液呈红色粘稠混悬液。红细胞数量正常情况下保持相对稳定的。多数鱼100—300万个/mm3，高者可达400万个/mm3低者数十万/mm3。鱼类红细胞数也因性别不同而有差异，一般雄鱼的红细胞数比雌鱼多。此外鱼类红细胞数量常因鱼种、年龄、外界环境变化、机体不同生理状况（运动状况、患病、营养状况等）而出现一定的差异。环境变化如长期缺氧红细胞代偿性增多。鱼类白细胞数量随种类、年龄、生理状况（产卵）、疾病以及一些外界环境因素影响而变化，此外，鱼类白细胞还与饲养条件、营养状况有关：饱食消化力旺盛时多，长期饥饿白细胞（特别是嗜酸性白细胞）显著减少。[注意事项]1、各种用具要事前清洗。清洗吸管时按照蒸馏水（两次）→95%酒精（两次）→乙醚（两次）的方法清洗。计数室用蒸馏水洗后，再用软纱布或擦镜纸吸干。2、采血要求迅速、准确，不能凝血，也不能有气泡，否则弃去重采。3、血吸管用完后必须立即清洗干净，以防血液凝固堵塞管口。[思考题]1、综合实验所得结果，与红、白细胞的正常值相对照，有何变异？为什么？2、为什么机体正常血细胞数可维持在相对稳定的数量水平？3、试讨论鱼类红细胞的正常值及其应用意义？4、白细胞数量的变化有何生理意义？5、血细胞计数室中央的大方各中每一种方格的容积是多少？附血细胞稀释液1、白细胞稀释液冰醋酸（破坏红细胞）1.5毫升1%龙胆紫（染白细胞核便于计数）1毫升蒸馏水加至100毫升2、红细胞稀释液NaCl(维持渗透压)0.5克Na2SO4(使溶液比重增加，红细胞分布不易下沉)2.5克HgCl（固定红细胞形状）0.25克蒸馏水加至100毫升附件二鱼类血涂片的制作和白细胞分类计数（必修）[目的与原理]了解各种类型白细胞的形态特征，掌握血涂片制作方法和白细胞分类计数方法，进行不同鱼类白细胞分类计数和血细胞形态特征、变形率等的观察。白细胞依据其形状、染色颗粒、细胞质和细胞核的形状大小可以进行分类。通常的分类方法是根据细胞浆中有无特殊的嗜色颗粒，将其分成颗粒细胞和无颗粒细胞。颗粒细胞又依据所含颗粒对染色剂反应特性，被区分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；无颗粒细胞则分成单核细胞和淋巴细胞。中性粒细胞有较强的吞噬能力，能将侵入机体的微生物消灭掉，并可参与免疫复合物和坏死组织的清除工作。嗜酸性粒细胞的细胞内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶，吞噬能力与中性粒细胞相当或稍弱，能吞噬抗原-抗体复合物，此外，嗜酸性粒细胞具有抗炎作用。嗜碱性粒细胞含有多种化学物质，如组织胺、肝素和5-羟色胺等，当抗原-抗体发生反应时，或机体在寒冷环境中时，都能引起嗜碱性粒细胞释放组织胺和肝素。血液中的单核细胞穿出血管壁进入组织，变成巨噬细胞，可对抗组织内的致病物，各种细菌和病毒。淋巴细胞有免疫功能，对异己构型的物质具有杀灭和消除作用。各种白细胞必须经过染色，才易于区分其类别。常用者为瑞氏（Wright’s）染色法和姬姆萨(Giemsa)染色法。[实验对象]鱼（淡水鱼和海水鱼均可）。[试剂与器材]试剂：染色液的配制：1、姬姆萨（Giemsa）染液的配制（1）原液配制：Giemsa粉剂（0.8g）；甘油（医用）50ml；甲醇50ml。将Giemsa粉剂溶于甲醇中，在乳钵中充分研