鹿仙草活性成分提取纯化及抗氧化护肝活性研究

鹿仙草活性成分提取纯化及抗氧化护肝活性研究筒鞘蛇菰（BalanophorainvolucrataHook.f.）为蛇菰科蛇菰属植物，别名鹿仙草[1]，蛇菰为寄生性草本植物，一年或多年生，无叶绿素和气孔，叶退化呈鳞片状或不存在，无正常根，靠根茎上的吸盘寄生于寄主植物的根上，根茎粗，通常分枝，表面常有瘤或星芒状皮孔，顶端具开裂的裂鞘。其全草入药,寄主分布于海拔500-2600m的多种林木,植株大多在中秋前后露出地面,生长季节性强,生长期短,故资源稀少。《本草纲目》将蛇菰以葛菜花之名列入菜部第28卷,别名葛乳。蛇菰资源分布：分布于福建、湖北、广东、广西、四川、云南等地。具有壮阳补肾，理气健脾，止血生肌，清热解毒的功效。民间常用于治疗阳痿，慢性肝炎，消化道出血，月经过多，遗精，肿瘤等症。蛇菰的品种来源较多,采用不同的提取方法和检测手段,得到的化学成分不尽相同。蛇菰属植物中所含化学成分有很大一部分是三萜类。另外甾醇类、多酚类[2]含量也较多，酚类有许多药理作用。1919年Simon[3]等人从蛇菰中分离出蛇菰素；到1998年，刘锡葵[4]等人正式提出蛇菰素分为蛇菰素A(balanophorinA)和蛇菰素B(balanophorinB)。含量较多的活性成分还有：苯丙素类化学成分，多数以酚类及其衍生物为主，如反式松柏苷。环烯醚萜和黄酮类：环烯醚萜苷、二氢查耳酮。鞣质：鞣质也是蛇菰属植物中的一类主要成分。到目前为止，人们共分离出34种鞣质类化合物。其他成分：从蛇孤属植物中分离出来的化合物还有硬脂酸，多糖等。鹿仙草有效成分的提取方法有水提法、有机溶剂提取和超声提取。水提法是中草药传统提取方法。适用于有效成分能溶于水、对湿和热较稳定的药材。戴忠[5]从鹿仙草的水溶性成分中分离出7种极性较强的化合物，分别为鞣花酸，香豆酸，咖啡酸，没食子酸，槲皮素，棉花苷，胡萝卜苷。鹿仙草中含有脂溶性成分，沈小玲[6]用工业酒精浸提鹿仙草中的有效成分，浸提3次，每次24h，合并浸提液，浓缩得粗品，然后用甲醇溶解，再经反复硅胶柱层析得到4种化合物：松柏甙、甲基松柏甙、β-谷甾醇、乙酸羽扇豆醇酯。鹿仙草的超声提取是由于超声波振动的空化、机械粉碎、搅拌以及热力学作用,空化泡周围的微流也对提取原料产生切向力以加速溶剂向细胞中的渗透；超声还可使植物药材细胞被击破,有利于溶剂浸入细胞中,加速原料中的有效成分进入溶剂,因此提高了有效成分的提出率。戴忠[7]提取蛇菰中的化学成分时，取2克样品，加入30%的甲醇40ml，超声30min，可使提取基本完成。使用不同的溶剂所提取的成分也不尽相同，可根据实验需要，采取适当的溶剂。鹿仙草的纯化方法主要有柱层析法。柱层析是以液体为流动相，利用溶质分子在流动相和固定相间的吸附和解析能力不同而实现分离的。高秀丽[8]以95%乙醇热回流提取3次，浓缩得到浸膏，上硅胶柱,用氯仿-甲醇系统梯度洗脱得到反式咖啡酸、反式香豆酸、氢醌。王彦改[9]用95%乙醇回流提取得粗液，然后用乙酸乙酯进行萃取，用SephadexLH-20(甲醇-水)、硅胶制备薄层(甲苯-甲酸乙酯-甲酸)和ToyopearlHW-40C(乙醇-水)进行反复色谱分离,得到8种纯度较高的化合物。蛇菰中含有三萜类、苯丙素类、甾醇类、鞣质类、黄酮类及其苷类等多种化学成分，其中三萜类、苯丙素类及黄酮类均具有抗氧化活性[10]。多酚类成分是蛇菰属植物中所含的一大类成分，是止血、抗炎、抗氧化以及抗肿瘤的主要有效成分。黄酮类多含有多羟基，是抗氧化、抗病毒以及抗肿瘤的主要有效成分。蛇菰属植物作为药用具有许多活性，除用于治疗肺热咳嗽、吐血、肠风下血、腰痛、痔疮外，还有一部分品种用于治疗肝炎、肿瘤，效果良好。在护肝方面，C.NLin等[11]对包括蛇菰素A和B在内的抗肝损伤药物进行的研究中已经证明了蛇菰素具有较强的保肝活性。戎聚全等[12]采用毒理和生化方法检测蛇菰的安全性及其解酒毒后小白鼠的死亡率和血中乙醇浓度的变化,观察蛇菰对修复酒精性肝损害的病理变化。研究发现蛇菰具有解酒毒作用。汤子春[13]进一步研究了鹿仙草护肝的作用机理，酒精在人体内经ADH和ALDH两种酶的作用，转化为CO2和水，鹿仙草的提取物可以提高ADH和ALDH的活性,可以加快乙醇在体内的代谢速度;还可以增强SOD和GSH-Px的活性,以清除酒精在人体内产生的自由基,保护细胞膜的结构和功能,减轻肝组织的损伤。以鹿仙草的乙酸乙酯提取物为原料制成一种醒酒剂[14]具有良好的解除急性酒精中毒及降低血液中的乙醇含量。在抗肿瘤方面，白树勋[15]等人对疏花蛇菰B.氯仿提取物的抗小鼠实体型肝肿瘤H22活性的研究表明，其具有良好的抗肿瘤活性。戴忠[7]也证明了蛇菰的乙酸乙酯提取物对小鼠实体型肝肿瘤H22有较强的抑制作用。经化学分离结果可知，乙酸乙酯的提取物中含有大量的酚酸类，尤其以没食子酸占主要量。文献研究表明[16]：没食子酸具有明显的抗肿瘤活性。作用机理主要有两种，一是没食子酸可引起肿瘤细胞染色体DNA在核小体间断裂，从而诱导肿瘤细胞调亡，其活性基团主要是三个邻羟基。二是没食子酸具有较强的抗氧化、抗自由基活性。氧化和自由基损伤被公认是引起细胞DNA损伤进而导致细胞恶变的重要机制之一。张金彦[17]利用拉曼光谱研究了鹿仙草对SMMC-7721肝癌细胞的作用，结果发现，鹿仙草可以与肝癌细胞内的DNA、蛋白质相作用，从而诱导肝癌细胞凋亡。药物可以使得DNA链发生断裂，DNA含量下降，但DNA构象并未发生反应，药物可能插入到碱基对之间，使DNA复制受到抑制，从而可能诱导细胞的凋亡，药物作用效果随药物浓度的增大而增加。国药准字Z20025653[18]对对肝癌细胞的生长有显著的抑制作用、对人体毒副作用低，可广泛用于对肝癌的治疗。抗氧化作用：自由基是在机体氧化反应中自然产生的强氧化性化合物，可损害机体的组织和细胞，引起慢性疾病及衰老效应，而抗氧化剂是一类能够阻断自由基产生和清除自由基的物质。适量补充外源性抗氧化剂来提高机体对自由基的清除能力，使机体内自由基产生与清除保持平衡，对于延缓人体衰老和预防各种老年性疾病具有重要意义。DPPH·是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517nm波长有较大吸收，当加入抗氧化剂后一部分自由基被清除，使在该波长下吸收减弱，可借此来评价某物质的抗氧化活性。邓靖[10]采用DPPH·法证明了蛇菰中含有抗氧化活性较好的物质，尤其是乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、乙醇提取物及水提粗多糖等极性较强的物质。由此推断出蛇菰中抗氧化物质应该主要是一些大极性物质，这些物质容易被乙酸乙酯、正丁醇、水等极性溶剂提取获得，而氯仿、石油醚等溶剂提取所得的弱极性物质活性很低或者不具活性。蛇菰各提取物对DPPH·的清除作用呈随浓度增大而增加趋势，但当达到一定浓度后样品对DPPH·的清除率随浓度增大，变化趋于平缓。王慧[19]等采用DPPH·法对筒鞘蛇菰提取物抗氧化作用研究中发现其对DPPH·有一定的清除率，且清除率随浓度的增大而升高，当其浓度达到4mg/mL时清除率能达到峰值0.9434，浓度大于4mg/mL后呈现出降低的趋势。在人类不断的与疾病作斗争的过程中，人们逐渐发现了许多疗效好、毒性低的药物。它们为人类的健康和繁衍做出了突出的贡献。中国是中草药的发源地，目前中国大约有12000种药用植物，古代先贤对中草药和中医药学的深入探索、研究和总结，使得中草药得到了最广泛的认同与应用。肝病是指发生在肝脏的病变。包括乙肝，甲肝，丙肝，肝硬化，脂肪化，肝癌，酒精肝等等多种肝病。近年来病毒性肝炎，肝纤维化，脂肪肝，酒精肝，药物性肝损害及肝硬化，肝癌等肝病是当今社会威胁人类健康的主要疾病之一。据最新统计病毒性肝炎和乙肝病毒携带者在我国人群当中有14%以上人口感染。不少研究表明鹿仙草中的萜类成分可有效地预防和治疗肝病。在药理研究方面，白树勋[15]等人证实了疏花蛇菰B.氯仿提取物具有良好的抗肿瘤活性。2003年，阮汉利[20]等研究了筒鞘蛇孤的镇痛抗炎作用。戎聚全[12]等对蛇孤的解酒毒作用做了一些研究。蛇菰属植物属于天然药物，疗效好且对人体的毒副作用小，堪称绿色疗法，所以，深入研究该属植物对于今后在抗肝炎，抗肿瘤方面的临床应用有着积极的意义。另外，蛇菰属植物在我国分布较广，资源丰实，具有较好的开发利用价值。鹿仙草的活性成分在护肝和治疗肝病方面有重要的作用，对人体的副作用小，值得进一步的研究与开发。在所参阅的大量文献当中，对鹿仙草的活性成分及药理作用方面的研究较多，很少涉及到对鹿仙草活性成分提取及纯化方面的研究，且方法简单，单一，普遍存在提取率偏低，纯度不高的缺点。本课题的主要解决的问题是探究和改进鹿仙草的提取工艺，找到一种经济、快速、简便、高效的方法以提高鹿仙草活性成分的产量和质量。[1]潘剑宇,周媛,邹坤.筒鞘蛇菰的化学成分研究[J].中草药.2008,39(3):327-331[2]JIANGZhH，YHirose，Hlwata，etal．CaffeoylcoumaroylandHexahydroxydiphenoylglucosesfromBalanophorajaponica．ChemPharmbull，2001，49(7)：887．[3]I.M.Simon.Balanophorin，Chem.Inst.ImP.AndRoy.Univ.Innsbruck.Monatsh，32，59-104(期刊)[4]刘锡葵,李忠荣,邱明华,等.印度蛇菰的三菇成分,1998,2(3):369一370[5]戴忠,王钢力,刘燕.思茅蛇菰的化学成分研究Ⅱ[J].中国中药杂志，2005,,30(14):1131-1132[6]沈小玲,胡英杰,沈月毛.筒鞘蛇煎的化学成分[J].中草药，1996,27（5）：259-260[7]戴忠，思茅蛇菰和穗花蛇菰化学成分研究(D)[8]高秀丽,张荣平,娄旭.鹿仙草化学成分的研究[J].中草药,2004,26(7):583[9]王彦改,田晋,马洁.多蕊蛇菰化学成分研究[J].中药材.2010,33(3):368-370[10]邓靖,莫正昌,汲广全.蛇菰提取物体外抗氧化活性研究[J].食品科学.2010,31(5):23-25[11]Ch.N.Lin,W.P.Tome,AntihepatotoxicPrinciplesofSambucusformosana[J].Plantamedica,1988,54(3):223.[12]戎聚全,张朝卿,沈振华,等.蛇菰抗酒毒的实验研究[J].中国民族民间医药杂志,2003,65:347[13]汤子春,邹坤.开口箭与筒鞘蛇菰提取物醒酒作用机制的研究[J].时珍国医国药.2007,18(12):2958-2960[14]200610019115.0[15]白树勋,张绍云,徐国辉等.鹿仙草“B”抗肝癌的研究[J].云南中医杂志,1984,3:53-54[16]李肖玲，崔岚，祝德秋.没食子酸生物学作用的研究进展[J].中国药师.2004,7(10):767－769[17]张金彦，郭建宇，蔡炜颖，拉曼光谱研究复方鹿仙草颗粒对SMMC-7721肝癌细胞的作用[J].光谱学与光谱分析．2008,28(11):2574-2577[18]200510011054.9[19]王慧等,张红歧.简鞘蛇菰提取物及松柏苷的抗氧化作用研[J].三峡大学学报(自然科学版)，2009，31(3)：99-101[20]阮汉利,李娟等.筒鞘蛇孤镇痛有效部位的筛选[J].医学导报,2006,25(5):383一384