麦秆的酸水解及细菌纤维素的制备

利用麦秆生产细菌纤维素的研究摘要本文主要探讨了以麦秆为原料，经酸水解及脱毒后用于制备细菌纤维素。通过正交试验优化麦秆酸水解条件，糖得率最高时的酸水解条件为：3％硫酸、水解时间75min、固液比为1:10、温度121℃。水解液的脱毒方法影响细菌纤维素的产量，Ca(OH)2结合活性炭的脱毒方法效果最好，以此法脱毒后的水解液为碳源生产细菌纤维素产量达到15.42mg/mL，比以甘露醇、蔗糖、葡萄糖为碳源分别高出50.28%、65.04%和69.88%,表明以麦秆为碳源制备细菌纤维素是可行的。关键词：细菌纤维素麦秆水解脱毒细菌纤维素（bacterialcellulose）是由部分细菌产生的细胞外纤维素，为了与植物来源的纤维素相区别，将其称为细菌纤维素或微生物纤维素。细菌纤维素在化学组成和分子结构上与植物纤维素相近,均是以β-1,4-糖苷键连接而成的高分子化合物。然而，与植物纤维素相比，细菌纤维素有许多独特的性质:(1)细菌纤维素纯度高，聚合度和结晶度高；(2)具有极强的持水性和透水透气性；(3)具有高杨氏模量、高抗张强度和极佳的形状维持能力；(4)良好的生物适应性和生物可降解性；(5)可利用广泛的基质进行生产；(6)生物合成时具有可调控性。基于以上特性，细菌纤维素在医药、生物医学工程、食品、造纸和声学器材等领域具有广泛的应用前景，关于细菌纤维素的研究和开发应用已成为当今生物材料的研究热点之一。然而目前细菌纤维素的生产成本仍较高，使其只能用于生产高附加值的产品，这严重制约了细菌纤维素的广泛应用。人们尝试多种方式降低细菌纤维素的生产成本，如通过细菌纤维素高产菌株的筛选与育种提高细菌纤维素的产量，优化生产工艺，寻找新的发酵原料等[1-4]，其中寻找新的发酵原料是主要研究方向。目前国际上细菌纤维素的生产主要以葡萄糖、甘露醇、蔗糖等试剂为碳源进行培养，使得细菌纤维素的生产成本较高。我国最初以椰子水为原料生产细菌纤维素，然而椰子水资源有限，受季节、地域的影响严重，用其生产细菌纤维素难以满足日益增长的消费需求[5]，于是人们探索其它原料，如以甲醇、乙醛、陈米、谷氨酸提取液、西瓜汁等发酵制备细菌纤维素[6-10]，邱开颜等利用魔芋水解物作为碳源生产细菌纤维素[11]。农作物秸秆是一种资源丰富、价格便宜的可再生资源，其主要组成成分是纤维素和半纤维素类多糖物质。这些多糖类物质经水解转化为低聚糖或单糖后如能作为生产细菌纤维素的碳源，不仅可以拓宽细菌纤维素的生产原料，而且使秸杆资源得到更好的利用，意义巨大。本研究以麦秆为原料，探索麦秆酸水解的适应条件，用麦秆水解物为碳源发酵制备细菌纤维素，为细菌纤维素的工业化生产奠定基础。1.实验材料与方法1.1实验材料⑴麦秆：采自江苏省无锡市，风干后粉碎密封保存。⑵菌种：醋酸杆菌（Acetobacterxylinum）⑶培养基斜面培养基：D-甘露醇25g/l，酵母菌粉5g/l，胰蛋白胨3g/l，琼脂25g/l，pH值5.0。种子培养基：D-甘露醇25g/l，酵母菌粉5g/l，胰蛋白胨3g/l，pH值5.0。发酵培养基：碳源25g/l（以还原糖计），酵母菌粉5g/l，胰蛋白胨3g/l，pH值5.0。1.2实验方法⑴麦秆的稀硫酸水解为优化麦秆的稀酸水解条件，实验对硫酸浓度、水解时间、固液比三因素进行优化，按L16（45）正交表进行实验设计（见表1）。取若干个250mL锥形瓶，分别加入6g（风干重）麦秆，再加入不同浓度的硫酸，然后放入高压蒸汽灭菌锅，在121℃下分别反应30min、45min、60min、75min。水解完毕后，水解液和残渣用布氏漏斗过滤分开，调水解液pH值在5～7之间，用DNS法测水解液还原糖含量。得糖率的计算见下式。表1正交试验因素水平表Table1Factorsandlevelsoforthogonalexperiment水平A(硫酸浓度)B(水解时间)C(固液比)11%30min1:623%45min1:835%60min1:1047%75min1:12%100%半纤维素百分含量麦秆绝干重还原糖浓度水解液体积）（得糖率A%100%含量纤维素和半纤维素百分麦秆绝干重还原糖浓度水解液体积）（得糖率B⑵水解液的脱毒麦秆水解液分别按表2的方法脱毒。表2麦秆水解液脱毒方法Table2Methodsofdetoxificationofdilute-acidhydrolysatesfromwheatstraw编号脱毒方法A5用NaOH调水解液pH值至10.0，30℃水浴反应12h，调pH值至5.0左右，加入2％活性炭，反应5min，过滤并调pH值至5.0左右A6用NaOH调水解液pH值至5.0，加漆酶2.75U/mL，30℃水浴反应12h，然后过滤并调pH值至5.0左右B5用Ca(OH)2调水解液pH值至10.0，30℃水浴反应12h，调pH值至5.0左右，加入2％活性炭，反应5min，过滤并调pH值至5.0左右B6用Ca(OH)2调水解液pH值至5.0，加漆酶2.75U/mL,30℃水浴反应12h，然后过滤并调pH值至5.0左右C5用25%氨水调水解液pH值至10.0，30℃水浴反应12h，调pH值至5.0左右，加入2％活性炭，反应5min，过滤并调pH值至5.0左右C6用25%氨水水解液pH值至5.0，加漆酶2.75U/mL,30℃水浴反应12h，然后过滤并调pH值至5.0左右⑶种子液的制备从活化斜面上取2环醋酸杆菌接入装有50ml种子培养基的锥形瓶中，在30℃、130rpm下于摇床中培养1天。⑷细菌纤维素的制备取培养1天的种子液以6%接种量接种液体培养基，30℃静态培养11天。培养得到的细菌纤维素膜用清水冲去部分杂质，然后转移至预先恒重的G3玻砂漏斗中，105℃烘至恒重，称重得到细菌纤维素的绝干重。⑸水解液的元素分析将麦秆水解液的糖浓度稀释为25mg/mL，加5%硝酸，用元素分析仪对水解液中的Fe，Cr，Ni，Cu，Ca，Na等进行测定。2.结果与讨论2.1麦秆的稀酸水解麦秆酸水解过程中，所用酸的浓度、水解时间、固液比等均影响其水解得糖率，为探索麦秆最适水解条件，实验在固定温度（121℃）下，分别考察硫酸浓度、水解时间、固液比对水解得糖率的影响。实验采用三水平四因素正交试验，试验结果见表3。从表中可以看出，处理条件为：3％硫酸、水解时间75min、固液比1:10时得糖率最高，在此条件下得糖率A为117.98%，得糖率B为45.86%。得糖率A超过100%，是因为在计算得糖率A时，分母是半纤维素，酸水解时不仅半纤维素发生了水解，部分纤维素也可能发生水解，从而使得糖率A超过100%。纤维素是由葡萄糖聚合而成的大分子，聚合度高、分子量大、结晶区多，在稀酸中不易降解。半纤维素是多缩戊糖和多缩己糖的混合物，聚合度较低、分子量小，易于水解。得糖率A比得糖率B高，说明在高温酸水解过程中，麦秆中的半纤维素比纤维素容易水解。从极差分析结果看，酸的浓度对得糖率的影响最大，其次为固液比，水解时间对得糖率的影响最小。从方差分析可知（表4、表5），各因素对得糖率的影响均不显著。表3麦秆酸水解正交实验结果Table3Theresultoftheorthogonalexperiment试验号ABC得糖率A(%)得糖率B(%)111198.3038.21212298.4938.283133113.4644.104144115.4544.885212107.9541.966221109.4642.547234113.6344.178243117.9845.86931377.7530.2210324102.6739.911133173.7728.671234288.3934.361341493.2936.261442389.3834.741543283.4732.441644165.6925.53得糖率A(%)k1106.4394.3286.80k2112.25100.0094.57k385.6496.0899.64k482.9696.88106.26R29.305.6819.46得糖率B(%)k141.3736.6633.74k243.6338.8736.76k333.2937.3538.73k432.2437.6641.30R11.392.207.57表4得糖率A的方差分析Table4VarianceanalysisoftheyieldofsugrasA方差来源自由度偏差平方和F比F0.05浓度32590.1792.2413.86时间367.5880.058固液比3809.6810.701误差93467.45表5得糖率B的方差分析Table5VarianceanalysisoftheyieldofsugrasB方差来源自由度偏差平方和F比F0.05浓度3391.4392.243.86时间310.1980.058固液比3122.4960.701误差9524.132.2麦秆水解液脱毒及细菌纤维素制备在木质纤维素类物质酸水解中，纤维素和半纤维素的水解物主要为单糖，木质素的水解物主要为多种单环芳香族化合物。除上述主要产物外，水解液中还含有一些水解反应的副产物，如甲酸、乙酸、糠醛、羟甲基糠醛、糖醛酸、己糖酸和芳香族类化合物等，这些物质通常会抑制微生物生长代谢，影响水解产物的生物利用[12]。为除去麦秆酸水解液中的抑制物，本文尝试几种方法对麦秆水解液进行脱毒，脱毒后的水解液用于培养醋酸杆菌制备细菌纤维素。通过观察培养后生成的细菌纤维素膜发现，水解液经不同方法脱毒后均可用于培养醋酸杆菌合成细菌纤维素，静态培养时成膜情况较好。从合成的细菌纤维素产量看，脱毒方法对细菌纤维素产量的影响较大（图1），脱毒方法为B5时细菌纤维素的产量最高，可达15.42mg/mL，即Ca(OH)2结合活性炭的脱毒方法效果最好。在相同的碳源浓度和培养条件下，用方法B5脱毒的水解液比以甘露醇、蔗糖、葡萄糖等为碳源更有利于细菌纤维素的产生，产量分别增加50.28%、65.04%和69.88%，可见麦秆水解液脱毒后可用于细菌纤维素的生产。比较各脱毒方法，发现调水解液pH值至10再结合活性炭的方法（A5，B5，C5）比调水解液pH值至5再结合漆酶的方法（A6，B6，C6）脱毒效果好。从脱毒所用的碱来看，用Ca(OH)2调节水解液pH值脱毒效果最好，其次分别为NaOH和氨水，这与文献报道一致[13]。图1不同碳源对细菌纤维素产量的影响Fig.1Effectofdifferentcarbonsourcesontheproductionofbacterialcellulose2.3水解液元素分析实验中发现，麦秆水解液采用方法B5（Ca(OH)2调水解液pH值）脱毒好于方法A5（NaOH调水解液pH值），细菌纤维素产量比采用常规碳源时还高，为分析造成差异的原因，对秸秆水解液进行了元素分析。实验结果见表6，与未脱A5B5C5A6B6C6甘露醇蔗糖葡萄糖--024681012141618单位培养基产细菌纤维素mg/mL碳源类型毒水解液相比，麦秆水解液经A5、B5方法脱毒后，元素Fe、Cr、Ni、Cu的含量都有不同程度的降低。两种处理方法所造成的主要差别是调节水解液pH值时添加碱所造成添加离子浓度的不同，对其他元素影响较小。水解液成分复杂，仅根据金属离子的浓度来分析不同脱毒方法对细菌纤维素产量的影响是不全面的，对于水解液脱毒效果的机理研究有待进一步探讨。表6水解液的元素分析Table6Elementanalysisofhydrolysatesofwheatstraw水解液元素(µg/mL)Ca,NaFeCrNiCu未脱毒154.57523.8819.26300.0890.271A5法脱毒60.265111.5235.8470.0110.0430.052B5法脱毒828.09429.16115.4440.1500.0800.024结论本文主要尝试了以麦秆为原料制备细菌纤维素，实验结果表明，麦秸的水解条件和脱毒方法均影响细菌纤维素的生成。麦秆酸水解的适宜条件为：3％硫酸、水解时