信号转导研究方法

信号转导通路研究策略和常用方法•搞懂信号通路•查找文献，了解信号系统的研究进展和热点•找到研究点功能分析表达分析如何分析信号蛋白？何时何地表达基因过表达，或基因沉默(细胞水平和整体水平)相互作用蛋白立体论证基因水平转录水平转录后加工翻译水平翻译后加工mRNA和蛋白质降解蛋白质基因表达可以在不同层次上调节基因表达分析方法启动子分析:---EMSA---Reportergeneassay---CHIPassay---NuclearRun-onassay---DNAFoot-printingassay---DNAtruncationandsite-directedmutagenesis翻译水平分析:---WesternBlots---ImmunocytochemistryImmunohistochemistry---Proteinmodification---Proteomics转录水平分析:---RT-PCR---RealTimePCR---Insituhybridization---Northernblots---RNaseprotectionassay---Primerextentionassay比较转录组学:---Differentialscreening---Subtractivehybridization---Differentialdisplay---Array-basedmethods1.蛋白质表达水平和细胞内定位研究信号蛋白分子表达水平检测:Westernblotanalysis.ELISAProteomics信号蛋白分子在细胞内定位研究:Immunohistochemistry/ImmunocytochemistryImmunofluorescence(IF)Greenfluorescentprotein(GFP)-fusionprotein—typically,livecells.印迹技术blotting将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介质上，并加以检测分析的技术。应用：DNA、RNA、蛋白质的检测DNA印迹:SouthernblottingRNA印迹:Northernblotting蛋白质印迹:Westernblotting又称蛋白质印迹技术或免疫印迹技术。蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移（电转）至膜性支持物上(NC膜）,再与溶液中的抗体相互结合的技术。主要用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析、蛋白质化学修饰（磷酸化），以及蛋白质分子间的相互作用研究等。WesternblottingElectrophoresis转膜ProteinHRPDABH2O21Ab2Ab抽提细胞蛋白，定量聚丙烯酰胺凝胶电泳与特异性抗体杂交。根据标记物特点显色硝酸纤维素膜目的蛋白质抗目的蛋白一抗标记的二抗偶联的碱性磷酸酶磷酸化生色体系脱磷酸显色采用Westernblot方法检测蛋白质原理示意图应用举例某药物是否可引起目的蛋白的表达变化（上调或下调）？分别抽提细胞蛋白（未处理、药物处理），定量相同质量上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹（电转移）杂交（抗体）显色/显影根据显影结果判断：内参目标蛋白检测标本很多的情况下Western无法满足高通量的需求ELISA/Phosphospecific-ELISAs(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)检测蛋白质表达量或者活性状态(化学修饰-磷酸化)比westernblot更快速、更高效.蛋白质组（proteome）：一个基因组所表达的全部蛋白质.蛋白质组学（proteomics)：研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。蛋白质组学(Proteomics)同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同；在空间和时间上呈动态变化蛋白质组学研究技术平台(高效率,高通量)双向电泳分离样品蛋白质蛋白质点的定位和切取质谱分析第一向：等电聚焦电泳（IEF）第二向：SDS-PAGE电泳免疫荧光技术Immunofluorescence(IF)利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜可对抗原进行定性或定位检测。采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子（DoubleIF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测。2.蛋白质与蛋白质相互作用研究技术:Co-IP（免疫共沉淀）withantibodyagainstoneproteinfollowedbyWesternblotwithantibodyagainstanotherproteinGSTpull-downassayYeasttwo-hybridassayFRET(fluorescenceresonanceenergytransfer)assayagarosebeadIP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proteinA/G”能特异结合免疫球蛋白FC片段的现象而发展的方法。目前多用精制的proteinA/G预先结合固化在agarosebeads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA/G就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。proteinA抗原抗体YABY裂解细胞免疫沉淀蛋白质X免疫共沉淀（Co-IP）技术非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。若用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。进一步进行WesternBlot和质谱分析。常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质相互作用。WesternBlot和质谱分析Co-IP工作示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYGST融合蛋白进行Pulldown实验GSTpull-downassay原理将GST融合蛋白(taggedprotein(标记蛋白)orthebait(饵蛋白)，GST,His6,Flag,biotin…)作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白(testprotein,orprey被扑获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。GST-PulldownAssay转录激活因子DNA结合结构域(BD)转录激活结构域(AD)酵母双杂交技术酵母双杂交技术是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。在酵母细胞中分析蛋白质相互作用。以真核细胞转录激活因子的结构为基础。将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体(“诱饵”bait)，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体(“猎物”或靶蛋白preyortargetprotein);当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞含有上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。但限于核内表达的蛋白质的相互作用。酵母双杂交系统荧光共振能量转移(FRET)是对生物大分子之间相互作用定性、定量检测的一种有效方法，是在活体细胞中实时地对生物大分子之间的相互作用进行动态监测.两个携带不同荧光基团（如GFP、YFP、CFP等）的大分子在相互间距离足够近时会发生激发态能量非放射性地由一个荧光基团（供体）向另一个荧光基团（受体）转移的现象。如果发生FRET，则供体信号将淬灭而受体信号将激活或增强.FRET检测系统可以快速高效地捕获来自标定分子间相互作用的短暂微弱的荧光信号，而以分子尺度分辨出供体-受体的平均距离，并能显示出受体-供体的相互作用。蛋白质直接相互作用的荧光共振能量转移FluorescenceResonanceEnergyTransfer以光线激发后，供体荧光基团(ECFP–X)会将激发能量转移至距离10–100Å以内的受体荧光基团(EGFP–Y)，使之发出荧光。通过检测受体荧光基团激发的荧光即可确认两蛋白质间的相互作用。ECFP：强化型蓝荧光蛋白；EGFP：强化型绿荧光蛋白FRET3.磷酸化蛋白质研究方法:Westernblotwithphospho-specificantibodies.ELISAPhosphopeptideandphosphoaminoacidanalysisbymassspectrophotometricanalysis.激酶活性的测定信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化，因而对这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义。常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。4.基因转录活性检测信号蛋白转录水平表达（mRNA）的检测:RT-PCR/RealtimeRT-PCRNorthernblotanalysis.“genechip”tomeasurechangesingeneexpressionatlargerscales.基因启动子/增强子转录活性的检测:Transientorstablereporterassay—luciferase(Luc).RT-PCRMarker组1组2内参基因目的基因RT：以polyT为引物，在逆转录酶催化下cDNA合成PCR：特异引物进行目的DNA的扩增应用：1.获得目的基因（编码蛋白）2.比较不同条件下mRNA变化RT-PCRReal-timePCR用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析荧光染料：每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去，染料一结合就产生荧光信号，信号强度与DNA分子总数目成正比。①②TaqMan探针寡核苷酸探针的5′端标记一个荧光报告基团（reporter），3′端标记一个荧光淬灭基团（quencher）。报告荧光基团与淬灭基团分离，荧光共振能量转移不再发生，报告基团发绿色荧光当激发光照射到探针时，被激发的报告基团将能量转移给附近的淬灭基团而不发光。每产生一条DNA链，就切断一条探针，每切断一条探针，就产生一个单位信号，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。5.蛋白质与DNA相互作用的研究技术:Gelshift(orelectrophoreticmobilityshift)assay(EMSA)—typically,withsmallerDNAsizes.Chromatin-immunoprecipitation(ChIP)assay—toassessoccupancyofDNAsiteswithspecificfactorsinlivingcells.Gelshift染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）——体内分析蛋白质-DNA相互作用真核生物基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。CHIP的基本原理:在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后免疫沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得体内蛋白质与DNA相互作用的信息。甲醛处理使蛋白质与染色质DNA交联；超声波或酶处理使染色质DNA片段化；抗体沉淀蛋白质-DNA交联复合体（