零原核胚胎利用价值的探讨

零原核胚胎利用价值的探讨陈国勇，刘芸＊，张群芳，黄吴键，林春丽（南京军区福州总医院妇产科，福州３５００２５）【摘要】目的比较未见原核（０ＰＮ）与正常原核（２ＰＮ）来源优质囊胚的妊娠结局，探讨０ＰＮ胚胎的利用价值。方法收集２０１３年１月至２０１４年１２月在本中心行助孕治疗、鲜胚移植失败或取消移植后行冻融优质囊胚移植的７８４例患者为研究对象，以移植０ＰＮ来源冻融优质囊胚的患者为０ＰＮ组，移植２ＰＮ来源冻融优质囊胚的患者为２ＰＮ组，分析０ＰＮ、２ＰＮ卵裂胚的优质囊胚形成率，并比较两组患者的胚胎种植率、临床妊娠率和流产率等。结果０ＰＮ卵裂胚的总优质囊胚形成率显著低于２ＰＮ卵裂胚（３７．１７％ｖｓ．４４．４９％），但第３天卵裂球８细胞以上胚胎优质囊胚形成率０ＰＮ胚胎显著高于２ＰＮ胚胎（６７．４５％ｖｓ．５７．１６％）（Ｐ均＜０．０１）。囊胚移植后０ＰＮ组的种植率（７１．１５％ｖｓ．５３．７４％）、临床妊娠率（８０．００％ｖｓ．６４．３２％）、抱婴率（６８．００％ｖｓ．５５．７１％）显著高于２ＰＮ组（Ｐ均＜０．０５）；两组出生婴儿体重、身长、Ａｐｇａｒ评分、畸形率等比较无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。结论０ＰＮ来源优质囊胚的利用价值值得关注。０ＰＮ胚胎可能只是在设定的观察时间内未观察到原核，而并不一定是异常受精。对于无可利用优质胚胎的患者，临床上可以将０ＰＮ胚胎继续培养至囊胚，然后进行移植，以提高患者的胚胎利用率和临床妊娠率。但因为０ＰＮ胚胎存在染色体异常的可能性仍较大，建议能结合遗传学筛查技术，以获得更确切的信息，指导临床应用。【关键词】原核；细胞数；优质囊胚形成率；种植率；临床妊娠率辅助生殖助孕治疗中，胚胎培养在原核观察期就已经表现出多样性，多原核胚胎一般作为废弃胚胎被销毁，正常受精的２原核（２ＰＮ）胚胎则继续培养，但未观察到原核（０ＰＮ）、仅观察到１原核（１ＰＮ）胚胎的利用情况仍然存在争议［１］。现就本中心０ＰＮ胚胎的利用情况进行探讨，以期为临床应用提供一定参考。资料与方法一、研究对象及分组收集２０１３年１月至２０１４年１２月在本中心行体外受精－胚胎移植（ＩＶＦ－ＥＴ）助孕治疗、有囊胚培养的１５８３例患者（共７７６５个胚胎）的临床资料。选择其中鲜胚移植失败或取消移植，而后行解冻后优质囊胚移植的７８４例患者为研究对象。分组情况：无２ＰＮ来源优质囊胚，行０ＰＮ来源优质囊胚解冻后移植的患者为０ＰＮ组；行２ＰＮ来源优质囊胚解冻后移植的患者为２ＰＮ组。本研究中０ＰＮ胚胎指授精后１６～１８ｈ观察到明确２极体（２ＰＢ）、０ＰＮ但第３天（Ｄ３）有卵裂的胚胎。二、研究方法１．控制性超促排卵：所有患者均采用改良长方案促排卵：于月经Ｄ３开始使用达菲林（醋酸曲普瑞林，Ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ，３．７５ｍｇ／支，博福益普生，法国）约１．３１ｍｇ进行垂体降调节，根据患者体重和卵巢情况，使用重组人卵泡刺激素（果纳芬，Ｇｏｎａｌ－Ｆ，７５Ｕ／支，默克雪兰诺，瑞士）和人绝经期促性腺激素（ＨＭＧ，５０Ｕ／支，珠海丽珠）进行促排和启动，剂量１５０～２２５Ｕ，根据卵泡发育情况调整用药剂量。Ｂ超监测卵泡发育情况，观察血清雌二醇（Ｅ２）、促黄体生成素（ＬＨ）、孕酮（Ｐ）水平，当３个以上主导卵泡直径达１８ｍｍ时肌肉注射重组人绒毛膜促性腺激素（ｒＨＣＧ，默克雪兰诺，德国）２５０Ｕ和注射用ＨＣＧ（珠海丽珠）２０００Ｕ，３６～３８ｈ后阴道Ｂ超引导下行卵泡穿刺取卵。２．ＩＶＦ与胚胎处理：取卵后，在体视显微镜下分拣出卵冠丘复合物，置于覆盖矿物油授精液（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ，瑞典）的四孔板上，置３７℃、６％ＣＯ２、５％Ｏ２培养箱中培养３～４ｈ，进行短时授精。授精后４～６ｈ去除卵丘颗粒细胞，观察第二极体产生情况判断是否受精。受精情况达标者换Ｇ１培养液（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ，瑞典）进行单胚胎培养，培养至次晨（授精后１６～１８ｈ）观察原核、极体发生情况，以２ＰＮ（２ＰＢ）为正常受精。Ｄ３观察胚胎后，挑选１～２个２ＰＮ来源的优质卵裂胚进行移植或冷冻。其余卵裂胚除多原核胚胎遗弃外，均进行囊胚培养，换Ｇ２培养液（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ，瑞典）继续培养３６～４８ｈ，观察囊胚生长情况，选择质量较好的囊胚进行冷冻。Ｇ１、Ｇ２培养均为２５μｌ／滴，覆盖矿物油，单独培养，培养环境均为３７℃、６％ＣＯ２、５％Ｏ２的培养箱。所有胚胎操作均统一由２名有经验的胚胎操作者完成。胚胎观察时间：以２０１０年伊斯坦布尔胚胎共识评估时间点［２］评估胚胎：授精后（１７±１）ｈ观察原核（Ｄ１）、（６８±１）ｈ观察卵裂胚（Ｄ３）、［（１１６／１４０／１６４）±２］ｈ观察囊胚生长情况。胚胎评估方法：以改良的形态学评估方法为标准：（１）卵裂胚评估参考Ｒａｃｏｗｓｋｙ、Ｖｅｅｃｋ等的卵裂胚评估办法［３－４］，结合本中心实际操作进行评估。Ｉ级：卵裂球大小均匀且碎片＜１０％；Ⅱ级：卵裂球大小轻度不均且碎片＜２０％，或卵裂球大小均匀且碎片１０％～２０％；Ⅲ级：卵裂球大小严重不均且碎片＜５０％，或卵裂球无大小严重不均、碎片２０％～５０％；Ⅳ级：碎片≥５０％。（２）优质囊胚评估标准：按Ｇａｒｄｎｅｒ分级标准［５］对囊胚评分，根据囊胚的扩张和孵出程度进行分期，根据内细胞团（ＩＣＭ）和滋养层细胞（ＴＥ）评分进行分级，本中心以４ＢＢ以上级别囊胚为优质囊胚。囊胚的冻融及移植：囊胚冷冻均采用玻璃化冷冻法，使用实验室自制的玻璃化冷冻试剂。鲜胚移植失败后，择期行冻融囊胚移植。解冻囊胚，解冻后２ｈ进行质量评估：囊腔复膨充分，未见明显的ＩＣＭ、ＴＥ退化者视为复苏成功。复苏成功的囊胚换移植液直接进行移植，移植管采用美国ＣＯＯＫ移植管，移植液为Ｇ２与人血清白蛋白的混合液。３．观察指标：观察两组的种植率、妊娠率、流产率及抱婴率；种植率＝孕囊数／移植胚数；临床妊娠率＝临床妊娠例数／移植患者例数；流产率＝流产例数／妊娠例数；抱婴率＝获得活产的患者例数／移植患者例数。４．签署知情同意书：与无２ＰＮ来源优质囊胚的患者沟通，告知其具体情况及移植０ＰＮ来源囊胚可能存在的风险，患者自愿接受０ＰＮ来源的优质囊胚解冻移植，签署知情同意书，并建议患者成功妊娠后进行必要的产前诊断与检查。三、统计学分析使用ＳＰＳＳ１９．０统计软件进行数据统计分析，计量资料组间比较采用ｔ检验，率的比较采用卡方检验，Ｐ＜０．０５为差异具有统计学意义。结果一、０ＰＮ来源和２ＰＮ来源优质囊胚形成情况比较本研究共收集了８６９个０ＰＮ胚胎进行囊胚培养，共形成优质囊胚３２３个，优质囊胚形成率为３７．１７％；同时期收集２ＰＮ胚胎共６８９６个，继续囊胚培养后形成优质囊胚３０６８个，优质囊胚形成率为４４．４５％。０ＰＮ来源优质囊胚形成率显著低于２ＰＮ来源优质囊胚形成率（Ｐ＜０．０１）（表１）。其中Ｄ３发育达８细胞以上的０ＰＮ胚胎２９８个，形成优质囊胚２０１个，优质囊胚形成率６７．４５％；Ｄ３发育达８细胞以上的２ＰＮ胚胎１４４５个，形成优质囊胚８２６个，优质囊胚形成率５７．１６％。０ＰＮ组显著高于２ＰＮ组（Ｐ＜０．０１）（表１）。二、两组患者一般情况比较０ＰＮ和２ＰＮ两组患者的平均年龄、移植日子宫内膜、移植囊胚数等一般情况比较，均无显著性差异（Ｐ＞０．０５）（表２）。三、两组患者的妊娠情况比较有７５例患者移植了解冻的０ＰＮ来源优质囊胚，共１０４个囊胚，最后６０例患者获得临床妊娠，见孕囊７４个，流产９例。２ＰＮ组７０９例患者移植解冻后的２ＰＮ来源优质囊胚，共１０４４个囊胚，最后４５６例患者获得临床妊娠，见孕囊５６１个，流产６１例。０ＰＮ组的种植率、临床妊娠率、抱婴率均显著高于２ＰＮ组（Ｐ＜０．０５）（表３）。四、两组患者出生婴儿随访情况比较两组出生婴儿的出生孕周、体重、身长、Ａｐｇａｒ评分、畸形率等比较，均无显著性差异（Ｐ＞０．０５）（表４）。２ＰＮ组出生婴儿中有７例合并先天性畸形：２例先心病，１例先心病合并左侧断掌，１例蚕豆病，１例轻度唇腭裂，１例先天性膈疝，１例双足内翻畸形；０ＰＮ组出生婴儿中有１例先天畸形婴儿，为左耳轻度畸形合并单肾畸形。讨论胚胎的评估选择一直是辅助生殖技术领域热门的话题之一［２，６］，目前胚胎评价仍无严格统一的标准，学者们在这个领域进行了大量的相关研究，目前最常用的方法有形态学评估［３，６－７］，其他还有通过胚胎代谢产物检测［８－９］、胚胎细胞活检染色体检查［１０］、免疫或激素类物质测定［１１－１２］，以及红外光辅助分析优选胚胎［１３］、实时成像技术（ｔｉｍｅｌａｐｅｓ）［１４－１５］等方法来评估胚胎质量。胚胎形态学评价作为辅助生殖领域临床常规的评估方法，在ＩＶＦ－ＥＴ等助孕治疗中得到了广泛应用，通常根据早期卵裂、Ｄ２或Ｄ３卵裂情况来综合评价胚胎质量，以选择优质胚胎进行移植，以期提高临床妊娠率。受精是精子进入卵母细胞并与之融合的过程，精子的进入诱导第二极体排出，精子来源的染色体解聚，形成雄原核，卵母细胞形成雌原核。在精子和卵母细胞共培养１６～１８ｈ间观察（主要集中在约１８ｈ），可见雌原核和雄原核的视为正常受精。临床实践中有部分病例在精卵共培养１６～１８ｈ后进行观察时，未能见到原核但能观察到２ＰＢ，继续培养至Ｄ２、Ｄ３时仍可观察到卵裂，即０ＰＮ胚胎，甚至再继续培养后，这部分０ＰＮ胚胎可以继续发育为囊胚［１６－１７］。分析其原因，有可能０ＰＮ来源胚胎其原核形成时间出现了提前或推迟，即原核出现时间并不在１６～１８ｈ范围内，因此在设定的观察时间里未能观察到原核，但继续培养再观察时可以观察到卵裂。已有研究报道，这类０ＰＮ来源的囊胚移植后，也可正常发育甚至分娩正常新生儿［１８－１９］。本研究结果显示，在同一时期临床及实验室各项条件均稳定的情况下，０ＰＮ胚胎占受精胚胎总数（含０ＰＮ）的比例约为３％～５％，０ＰＮ胚胎继续培养后可以发育至囊胚，虽然优质囊胚的形成率要低于正常受精的２ＰＮ胚胎，但仍大大提高了卵母细胞的整体利用率。关于０ＰＮ胚胎的发育潜能，Ｗａｎｇ等［２０］、曾勇等［２１］曾研究报道０ＰＮ胚胎不如正常受精胚胎。本研究结果显示，０ＰＮ来源的优质囊胚形成率显著低于２ＰＮ来源者（３７．１７％ｖｓ．４４．４５％，Ｐ＜０．０５），与前述研究结果［２０－２１］一致。但进一步分析Ｄ３卵裂胚卵裂球数量≥８个的胚胎优质囊胚形成率，发现０ＰＮ来源的优质囊胚形成率显著高于２ＰＮ来源者（６７．４５％ｖｓ．５７．１６％，Ｐ＜０．０５），提示发育速度较慢的０ＰＮ来源胚胎优质囊胚形成率相对较低，这与之前的研究报道［１０，２１］结果相近，之前Ｓｅｌｉ等［１０］、曾勇等［２１］提出发育速度慢的胚胎染色体数目或结构异常的比例较大，相比正常胚胎发育潜能要低。推测发育潜能好的０ＰＮ胚胎可能其原核消失时间早于我们设定的观察期，即胚胎发育速度提前，其发育潜能可能类似受精卵发生早期卵裂，是发育潜能较好的表现，但这尚需进一步的研究探讨。０ＰＮ来源胚胎在Ｄ３胚胎移植时，一般不能被选择移植，但对于可利用胚胎稀少的患者，又恐丢弃了有正常发育潜能的胚胎，因此，将这些胚胎进一步培养至５～６ｄ囊胚阶段，如果发育成优质囊胚，则认为有进一步使用的价值。本研究中有７５例患者在签署知情同意书后移植了０ＰＮ来源的优质囊胚，６０例患者获得妊娠，临床妊娠率为８０％，甚至高于２ＰＮ组患者的临床妊娠率（Ｐ＜０．０１），这可能与本研究纳入患者数量较少，数据存在一定的偏倚有关，后期尚需收集更大样本量进行对照研究，以进一步探讨验证。本研究中０ＰＮ组流产率１５％，随访出生婴儿情况未见明显差异，出生婴儿６２例中仅有１例有左耳畸形合并单肾畸形，畸形发生率与移植２ＰＮ来源优质囊胚的患者比较无显著性差异（Ｐ＞０．０５），提示部分０ＰＮ来源的优质囊胚亦可能具有良好的发育潜能。综上所述，临床上对于无可利用优质胚胎的患者，可以选择继续培养０ＰＮ胚胎至囊胚期，选择发育成优质囊胚的胚胎进行移植，以提高患者的胚胎利用率和临床妊娠率。但因为０ＰＮ胚胎存在染色体异常的可能性仍较大，临床上胚胎移植前如能结合遗传学筛查技术，将可获得更确切的信息，指导临床应用。且本研究所纳入样本量较少，可能存在一定偏倚，后期需要进一步扩大样本