青藏高原藏药沙棘化学成分与生态因子相关性研究

青藏高原藏药沙棘化学成分与生态因子相关性研究摘要：目的：考察青藏高原地区沙棘化学成分含量与生态因子的相关性，探讨生态因子的与沙棘品质的关系。方法：应用1H-NMR对沙棘中苹果酸、葫芦巴碱等5种化学成分进行含量测定，根据实地调查获取的经度、纬度、海拔数据与从TCMGSI-Ⅱ分析系统平台获得不同产地的平均湿度、活动积温、日照、年降水量、年均温、7月平均温度、1月平均温度等7个生态因子数据，通过双变量相关分析、逐步回归分析方法，分析沙棘化学成分含量与生态因子之间的相关性。结果：影响沙棘药材中各化学成分的主要生态因子为七月平均温、日照时数、经度、年降水量、活动积温。结论：七月平均温、日照时数、经度影响沙棘化学成分累积的主要因素，这对沙棘资源的可持续开发利用、栽培具有重要的意义。关键词：青藏高原沙棘化学成分生态因子相关性CorrelativestudybetweenchemicalconstituentsandecologicalfactorsofHippophaerhamnoidesL.ofTibetanPlateauSuYongwen1,TanEr1,LiuChuan1,ZhaoCaiyun1,JiangDaofeng2,ZhangYi1(1.CollegeofEthnomedicine,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu611137,China;2.CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu611137,China;)Abstract:Objective:ToinvestigatethecorrelationbetweenecologicalfactorsoftheTibetanPlateauofHippophaerhamnoidesL.,andchemicalcomponentscontents．Methods：1H-NMRwasestablishedtoanalyzethecontentsoffivechemicals(Malicacid,Trigonelline,etc.).Basedonthefieldsurveytoobtainthelongitude,latitudeandelevationdata.Dataof7ecologicalfactors,includingaveragehumidity,activeaccumulatedtemperature,sunshineduration,annualprecipitation,annualaveragetemperature,averagetemperatureinJulyandJanuary,wereobtainedfromtheAnalysisSystemofTCMGSI-Ⅱ.Andthen,therelationshipofchemicalcompoundsandecologicalfactorswereanalyzedbybivariatecorrelationanalysisandstepwiseregressionanalysis.Results:InHippophaerhamnoidesL.,averagetemperatureinJuly，sunshineduration,longitude,annualprecipitationandactiveaccumulatedtemperatureareprincipalfactorsthatinfluencingonchemicalcomponents.Conclusions：AveragetemperatureinJuly,sunshinedurationandlongitudeareprimaryfactorsinfluencingaccumulationofchemicalcompoundsinHippophaerhamnoidesL.,whichisofgreatimportancetosustainabledevelopmentandutilizationofHippophaerhamnoidesL.resources.Keywords:TibetanPlateau；HippophaerhamnoidesL.；chemicalcomponents；ecologicalfactors；correlation沙棘，又名醋柳、酸刺、达尔布（藏名），为胡颓子科植物沙棘HippophaerhamnoidesL.的干燥成熟果实。沙棘药材为我国少数民族藏族的传统习用药材。沙棘在我国传统藏医药发展过程中已有2000多年的应用历史，早在公元8世纪，由帝尔玛·丹增彭措所著的藏医名著《晶珠本草》记载：达尔布除肺肿瘤，化血，治培根病[1]。”沙棘果实中含有丰富的维生素、矿物质、黄酮类化合物、类胡萝卜素和脂肪酸等营养物质，具有极高的营养价值。近几年来，沙棘资源开发利用和研究在国内外形成了热潮，受到多方面的关注和重视,一致认为沙棘是一种兼有生态、社会和经济效益的优良树种[2]。国内外对沙棘的研究主要集中在沙棘化学成分的分离鉴定与药理学研究，而对沙棘栽培技术及其种质资源的研究相对薄弱[3]。沙棘是一种落叶灌木或小乔木，是我国用于防沙治沙的优势树种，它适应能力强，繁殖容易，对土壤要求不苛刻，既耐水湿和盐碱，也耐干旱瘠薄，广大群众有长期栽培经验，在西北丘陵和风沙地区，被广泛用以荒山造林和防沙治沙。药材质量品质主要受到药材本身的遗传基因和外界的环境因素两方面的影响，二者在不同方面影响着植物自身化学代谢物的合成与积累。植物药材中的有效活性化学成分，大多数为植物自身产生的次数代谢化合物，是其在长期进化过程中与环境相互作用的结果。因此，揭示药材自身代谢化学成分与生态环境之间的相系，对中药材的质量控制与品质评价显得尤为重要。本文对青藏高原地区沙棘的资源状况、生态环境对沙棘化学成分的积累的影响进行了研究，为沙棘资源保护与利用、可持续发展及引种栽培提供参考[4-5]。1材料与方法1.1仪器和软件AgilentTechnologies600/54PremiumCompact(600MHz)核磁共振波谱仪（美国Agilent公司，第三军医大学-药物化学实验室）；MestReNova(version9.0,MestrelabsResearchSL,SantiagodeCompostela,Spain)软件，SIMCA-P(version11.5,Umetrics,Umeå,Sweden)软件，SartoriusBP221S电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ–300B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司，孔径0.45μm，有机系）；氘代甲醇（CD3OD,99.8%）、重水（D2O,99.9%）均购自北京京云重轻科技有限公司，3-三甲基甲硅烷基-2,2,3,3-四氘代丙酸钠（TSP，美国Sigma-Aldrich公司)。1.2材料通过前期野外实地采集沙棘样品，查阅地方植物志、沙棘植物标本和相关文献，最终确定青藏高原东缘为沙棘资源的主要分布区域，针对性地对青藏高原东缘地区进行沙棘资源调查与样品采集，本研究主要收集了四川、甘肃、青海、西藏、新疆5个不同产地的沙棘药材，共42个批次，药材经成都中医药大学民族医药学院张艺研究员鉴定为胡颓子科植物沙棘中国沙棘H.rhamnoidesL.subsp.sinensisRousi.、西藏沙棘H.tibetanaSchlechtend.、江孜沙棘H.rhamnoidesL.subsp.gyantsensisRousi的干燥成熟果实，沙棘资源野外调查采集地点见图1。图1青藏高原地区沙棘资源野外调查采样点分布图1.3沙棘产地生态因子数据的来源实验用于分析的经度、纬度及海拔等数据来源于野外种质资源调查过程中运用手持GPS仪实地采集记录，其他数据则从TCMGSI-Ⅱ分析系统中提取（由谢彩香副研究员提供）。1.4统计分析方法使用SPSS19.0统计软件针对沙棘药材中5个代谢成分的含量与气候因子进行相关性分析。2结果与分析2.1供试品溶液的制备取干燥的药材粉末0.2g，置于锥形瓶中，分别加入0.3mLD2O溶液（内含12.32mg/mLKH2PO4和0.04%TSP）和1mLCD3OD，密封，超声提取30min，取出，放冷，过0.45μm微孔滤膜，精密吸取取0.6mL滤液至标准的5mm核磁管中，按照上述的波谱条件进行1H-NMR测定，每个样品平行测定3次。2.2.1H-NMR测定条件测定条件为：测定温度=25℃；观察频率=599.89MHz；各项参数：扫描次数(nt)=128；谱线宽度(lb)=0.5Hz；弛豫时间(d1)=2s；FID转换所需点数(fn)=65536；FID信号采集时间(at)=1.7039s；谱宽(sw)=9615.4Hz；调用水峰压制序列(Presat)压制水峰信号，总测定时间=9min05s。2.3方法学考察代谢物组学研究的主要内容是凭借化学计量学方法对不同样品间的相似度或差异性进行评价[6]。为了同时考察仪器测量和供试品的制备的重复性，本研究选取了4批不同的沙棘药材，每批药材按“供试品溶液制备”项下的方法分别提取制备4次，依次进行1H-NMR测定，然后，每批药材均随机抽取1个提取液平行测定5次。结果表明，本实验所建立起来的沙棘药材代谢物组学的方法重复性良好，沙棘药材样品之间的差异性分析结果不会因样品制备、仪器测量、数据处理等外在因素的影响。2.5数据处理把通过NMR仪检测所得的1H-NMR自由衰减（FID）信号导入MestReNova(version9.0,MestrelabsResearchSL,SantiagodeCompostela,Spain)软件进行自动傅立叶转换，手动调整相位与基线，用TSP内标物做为基准校正化学位移。即：把TSP峰的化学位移定位0ppm。选择10.5~0.5ppm范围的1H-NMR图谱并以每0.04ppm化学位移值作为一个单位进行分段积分，并对总峰面积作归一化处理，最后以ASCII格式输出数据，得到各化学位移段与之相对应的信号峰面积值。2.6化学成分相对含量测定为了观察部分代谢物在3种基原品种沙棘药材中的实际差异，针对对部分代谢成分的特征信号（选择分离完全的特征质子信号峰）进行手动积分，平行三次，取平均值，即得到相应的积分面积，再根据每个测定样品中TSP的浓度(0.4mg/mL)，运用以下公式计算各产地样品中部分代谢成分的相对含量：mX=mST*(AX/AST)*(MWX/MWST)*(NST/NX)其中，mST为称取的内标物的质量，AST为内标物定量信号的积分面积，MWST为内标物的分子量，NST为内标物中引起该定量信号的质子数，AX为待测成分特征定量信号的积分面积，MWX为待测成分的分子量，NX为待测成分中引起该特征定量信号的质子数，mX为待测成分的含量。通过观察比对，最终发现：苹果酸（2.68ppm,dd,H-3）、葫芦巴碱（9.17ppm,s,H-1）、山奈素（8.06ppm,dd,H-2',6'）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（5.15ppm,d,H-1'）、L-白雀木醇（3.45ppm,s,-OCH3）这些特征信号峰分离度良好，因此选择它们用于代谢成分的定量积分。部分代谢成分的相对含量测定，结果见表1。表1不同取样点沙棘药材中5个代谢成分的含量取样地苹果酸(mg/g)葫芦巴碱(mg/g)山奈素(mg/g)槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(mg/g)L-白雀木醇(mg/g)四川康定县雅拉乡57.10.040.380.916.68四川阿坝县麦尔玛乡79.380.080.4917.6318.18四川阿坝县阿坝镇47.210.070.2912.1511.33四川阿坝县柯河乡59.190.070.219.6312.05四川壤塘县荣日达乡