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非编码RNA功能基因组研究的新热点一、非编码RNA的概念•非编码RNA（non-codingRNA，ncRNA）转录的终端产物不是蛋白质分子,而是功能多样的RNA分子.编码ncRNA的基因则被称作ncRNA基因•小的非mRNARNA（snmRNA）•小RNA（smallRNA,sRNA)•功能RNA（functionalRNA,fRNA）•细菌的非编码RNA称为小smallRNA,sRNA•将真核细胞非编码RNA称为非编码RNA（noncodingRNA，ncRNA）二ncRNA的分类1根据ncRNA在细胞内的分布分类(1)细胞核小分子RNA(smallnuclearRNA,snRNA)包括剪接体snRNA(U1,U2,U4,U5,U6)U7snRNA前者是mRNA前体剪接体的必要组分后者负责组蛋白前体mRNA3’-末端的形成。(2)核仁小RNA(smallnucleolarRNA,snoRNA)•是最丰富的一类ncRNA。•主要参与rRNA及其他RNA的修饰、加工、成熟等过程。(3)细胞质小RNA(smallcytoplasmicRNA,scRNA)分布在细胞质,主要在蛋白质合成过程起作用。(4)新近发现的Cajal小体(Cajalbodies,CBs)•是CBs特异性小RNA，能与U族snRNA碱基配对,可能对U1、U2、U4及U5进行位点特异性2′-O-核糖甲基化，并参与假尿嘧啶形成。2根据ncRNA的大小分类(1)21~25个核苷酸的ncRNA包括microRNA(miRNA)大家族小干扰RNA(smallinterferinRNA,siRNA)两种类型。它们是真核细胞基因表达的重要调控因子,也是自2001年以来倍受关注、研究最多和进展最快的一类。(2)100~200个核苷酸的smallRNA(sRNA)往往在细菌细胞起翻译调节子功能(3)10000个核苷酸的ncRNA参与更高级真核生物的基因沉默。三、snRNA•小核RNA(snRNA,smallnuclearRNA)•是一类称为小核核蛋白体复合体(snRNP)的组成成分，有U1，U2，U4，U5，U6snRNA等•其功能是•在hnRNA成熟转变为mRNA的过程中，•参与RNA的剪接•在将mRNA从细胞核运到细胞浆的过程中起着十分重要的作用snRNA分子大小（核苷酸数）功能U1165结合5′－剪接点U2185结合于分支点U3U4116结合于3′－剪接点U5145装配剪接颗粒U6106装配剪接颗粒小胞浆RNA•小胞浆RNA(scRNA,smallcytosolRNA)又称为7SLRNA•长约300个核苷酸，主要存在于细胞浆中•是蛋白质定位合成于粗面内质网上所需的信号识别体(signalrecognizationparticle)的组成成分。四、反义RNA•反义RNA(antisenseRNA)是指mRNA互补的RNA分子。•这种反义RNA能与mRNA分子特异性地互补结合，从而抑制该mRNA的加工与翻译，是原核细胞中基因表达的调控的一种方式。•许多实验证明，在真核细胞中亦存在反RNA，但其功能尚未全部明了。反义RNA的分类和作用机制•Ⅰ类•ⅠA类：直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或编码区，引起翻译的直接抑制•ⅠB类：与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解。•Ⅱ类•这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚，可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合。•Ⅲ类•这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。五microRNA•微RNA(microRNA,miRNA)的研究被美国《科学》杂志列为2002年世界十大科技突破之首。•miRNA是一组短小的、未带蛋白密码的RNA家族,它们是由19～25个核苷酸组成的单链RNA。•最早发现的2个miRNA是lin4和let7,它们都是由Dicer酶从前体RNA的茎环结构(stemloopstructure)上切割下来产生。•由于它们的长度比较短,而且作用时间短暂,因此一开始被称为smalltemporalRNA（stRNA）。•目前,在线虫、果蝇、水稻及人类等真核生物中已鉴定出大约200种miRNA,共有9种不止存在于一门中。•通过对这些miRNA的基因序列、加工表达方式、生理功能等方面的研究表明:miRNA具有与生物体阶段性发育密切相关的重要调控功能。1、miRNA的生成和结构•miRNA是一类长度为21～25nt的单链RNA分子片段,属于非蛋白编码RNA,其生成需核糖核酸酶Ⅲ(Dicer)和Argonaute(PIZ/PIWI)家族蛋白质的存在.•关于miRNA的生成机理所知甚少,一些miRNA间的联系密切,因此推测这些RNA可能是作为一个转录单位而被转录的•在细胞核内编码miRNAs的基因通过RNA聚合酶II的作用转录产生pri-microRNAs。•pri-microRNAs的大小通常只有几个kb，它与编码蛋白质的mRNAs的结构相似，具有3'端多聚腺苷酸化和5'端帽•Drosha与Drosha相关结合蛋白Pasha(也被称为DGCR8)组成的复合物剪切pri-microRNAs，使之形成具有茎环结构长度约70个核苷酸miRNA前体(pre-miRNAs)。•pre-miRNAs在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin5的作用下，从核内运输到胞质中。•在Dicer酶的作用下，miRNA前体被剪切成21-25个核苷酸长度的双链miRNA•miRNA两条链的3‘端均有2个游离核苷酸•最初，成熟miRNA与其互补序列互相结合成miRNA:miRNA*双螺旋结构(miRNA*是miRNA的互补序列)。•随后，双螺旋结构解旋，其中一条成熟的单链以不对称的方式结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)上。•该复合物会结合到有互补序列的mRNAs上，通过调整转录本的稳定性或靶mRNAs的翻译而调节基因表达。miRNAbiogenesis.AnmiRNAgeneistranscribed,generallybyRNApolymeraseII(PolII),generatingtheprimarymiRNA(pri-miRNA).Inthenucleus,theRNAseIIIendonucleaseDroshaandthedouble-strandedRNA-bindingdomain(dsRBD)proteinDGCR8/Pashacleavethepri-miRNAtoproducea2-nt3_overhangcontainingthe∼70-ntprecursormiRNA(pre-miRNA).Exportin-5transportsthepre-miRNAintothecytoplasm,whereitiscleavedbyanotherRNAseIIIendonuclease,Dicer,togetherwiththedsRBDproteinTRBP/Loquacious,releasingthe2-nt3_overhangcontaininga∼21-ntmiRNA:miRNA∗duplex.ThemiRNAstrandisloadedintoanArgonaute-containingRNA-inducedsilencingcomplex(RISC),whereasthemiRNA∗strandistypicallydegraded.2miRNA的特点•miRNA广泛存在于真核生物中,与其他寡核苷酸相比,主要有以下特征。•(1)一般来源于染色体非编码蛋白区的一段，本身不具有开放读框(ORF)及蛋白质编码基因的特点，现已鉴定的miRNA没有一个与已知的表达序列标签(EST)匹配，说明它们是由不同于mRNA的特殊转录单元表达的。•(2)成熟的miRNA长度一般为19-25nt，是由具有发夹结构的约70-90nt的单链RNA前体经过切酶(RNA)Dicer酶加工后生成,它们可以和上游或下游的序列不完全配对形成茎环结构，这种茎环结构参与了成熟miRNA的加工。•(3)成熟的miRNA5′端有一磷酸基团,3′端为羟基,定位于RNA前体的3′端或者5′端,且具有独特的序列特征。其5’端第一个碱基对U有强烈的倾向性,而对G却有抗性,但第2-4个碱基缺乏U,一般来讲,除第4个碱基外,其他位置碱基通常都缺乏C。•(4)miRNA基因不是随机排列的,其中有一些成簇存在。多个miRNA基因共同转录成一个前体RNA,然后成熟的miRNA从这个前体上加工而来。来自同一个基因簇中的miRNA具有较强的同源性,而不同基因簇中的miRNA同源性较弱。例如线虫中一组高度相关的miRNA基因：mir-35-mir-41,集中簇生在2号染色体的1kb片段上,共同转录成1个前体miRNA,然后加工形成7个成熟的miRNA,在胚胎和成虫早期均高度表达,而在其他发育阶段不表达。•(5)多数miRNA的基因结构和功能在进化中呈现保守性,各种miRNA都能在其他种系中找到同源体。•约12%的miRNA在线虫、果蝇、哺乳动物和植物中呈现保守性,经序列比对发现,这些保守片段中的碱基差异仅为1-2nt。其中miR-1、miR-34、miR-87在非脊椎动物和脊椎动物中高度保守。•(6)miRNA的表达具有阶段特异性和组织特异性,即在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达,在不同组织中表达不同类型的miRNA。•大多数miRNA的表达具有时序性,miR-3、miR-7基因只在果蝇胚胎形成时表达,而miR-1、miR-12的含量在果蝇幼虫阶段急剧上升,并在成虫期维持较高水平,同时在所有阶段都存在的miR-9和miR-11的含量却急剧减少。3miRNA的作用机制•单链miRNA与RISC结合形成miRNP复合体后,miRNA通过与靶基因的3’UTR区互补配对,指导miRNP复合体对靶基因mR-NA进行切割或者翻译抑制。•miRNA到底是抑制还是切割取决miRNA与靶序列互补配对的程度,互补配对高的可能进行切割,而配对低的只是抑制。•植物的miRNA与靶基因配对程度高,多数是进行切割•而动物中miRNA与靶序列的配对性不好,多数进行翻译抑制。•如线虫中,lin-4RNA并不降低lin-14和lin-28的mRNA水平,但能降低它们的蛋白水平。现在普遍认为,细胞中的miRNA能与靶基因mRNA的3’UTR部分配对,miRNP对其翻译的抑制。六siRNA•RNA干扰(RNAinterference,RNAi)•是指通过正反义RNA片段形成双链RNA从而特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象。•作为高效、特异的调节基因表达的技术,RNAi已成为基因功能研究的有力工具。RNAi的特征•1RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默机制,在此情况下,启动子是活跃的,外源基因也能被转录,但不能正常积累mRNA.•2高稳定性:•以3′端悬垂TT碱基的双链RNA尤为稳定,无需像反义核酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期;•3高效率:•能在低于反义核酸几个数量级的浓度下,使目标基因表达降到极低水平甚至完全“剔除”,从而产生缺失突变体表型;•比基因敲除技术更快更简单,可以仅仅在一周时间内关闭10个基因的表达,而且,那些在胚胎中敲除后导致死亡的基因,也可以利用RNAi的方法在培养细胞中进行研究;•4双干涉系统:•哺乳动物细胞中存在两条相互独立的“干涉”途径:•非特异性干涉反应,由30bp长序列双链RNA介导,可导致整个细胞非特异性蛋白合成抑制及RNA降解;•特异性干涉反应,由21～25ｎｔ的小干涉RNA介导,可逃避非特异性干涉系统的“监控”,只降解与其序列相应的单个基因的ｍRNA;•5高特异性:•小干涉RNA除正义链3′端的两个碱基在序列识别中不起主要