植物基因工程中的λ噬菌体载体

植物基因工程中的λ噬菌体载体2013年6月29日载体（vector）是把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。植物基因工程技术中尤为重要的是载体，不同目的基因需要采用不同的载体。组成植物基因工程载体系统常见的几种载体有：质粒λ噬菌体柯斯质粒(cosmid)m13单链噬菌体。•噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒，结构简单、基因数少，是分子生物学与基因工程的良好实验系统。•噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内。•噬菌体具有高效率的感染性和自主复制繁殖性能，使它能高效导入受体细胞，并能使携带的外源基因在受体细胞中高效扩增，所以噬菌体被开发成基因工程的有用载体。噬菌体(bacteriophage，phage)简介噬菌体分类毒性噬菌体（virulentphage）：吸附、穿入、生物合成、成熟、释放温和噬菌体（temperatephage）：转导、溶源性转换噬菌体温和噬菌体可有三种存在状态：溶菌周期的具有感染性的游离噬菌体颗粒；溶源周期的前噬菌体；宿主菌细胞质内的游离噬菌体核酸。DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态。目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体有：单链M13噬菌体载体；λ噬菌体载体；P1噬菌体载体；噬菌粒载体；等等。其中使用最多的是入噬菌体。λ噬菌体λ噬菌体是温和噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径约50nm的二十面体，其内包裹一长线状双链DNA分子（46500bp）。左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。中段：从J到N长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列，但非溶菌生长所必需右臂：长约10kb，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。基因组长约50kb，至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似性成簇排列。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。•在λDNA双链分子的两个5’端各有12个核苷酸单链的互补粘性末端，且两者的核苷酸序列互补，当λ噬菌体感染宿主细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环状DNA分子，这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点。cos位点（cohesiveendsite）如果将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA而端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。当噬菌体感染宿主细胞后,双链DNA分子通过cos而成环状。在感染早期,环状DNA分子进行转录。在此期间,噬菌体有两条复制途径可供选择:一是裂解生长。环状DNA分子在宿主细胞里复制若干次,合成了大量的噬菌体基因产物,形成子代噬菌体颗粒,成熟后使细菌裂解,释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。另一是溶源性生长。噬菌体DNA整合进宿主菌的基因组,然后像细菌染色体上的基因一样进行复制,并传递给下一代细菌。由于噬菌体头部包装容量的限制，重组λ-DNA分子大小只能在39—52kb之间。λ噬菌体的繁殖方式在感染的细胞内,噬菌体有两条复制途径:1、裂解生长2、溶源性生长DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态。λ噬菌体载体的构建构建方式：1、插入型。只具有一个限制酶位点，可便于外源DNA插入，这种载体叫插入型载体（insertionvectors）。2、置换型。含有二个限制酶切点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段所取代。这种载体叫置换型载体（replacementvectors）。至今已用噬菌体开发出许多插入型和置换型载体插入型载体:ZAP,ZAP,gt10,gt11等置换型载体:GEM-11,GEM-12,EMBL3,EMBL4等构建过程•野生型λ噬菌体DNA必须经过改造才能成为理想的载体，其构建过程主要有：①删除基因组中非必需区，建立外源DNA片段的替换点，增加承载外源DNA片段的容量。②在非必需区内插入或替换选择的标记基因和目的基因。③建立重组λDNA分子的体外包装系统，使之有效地感染受体细胞。简而言之，将目的基因插入或替换进入病毒基因组的可替代区，再利用病毒的侵染性，将目的基因导入受体细胞，这就是病毒作为“分子运输车”的基本机理。λ噬菌体载体的应用一、建立cDNA文库噬菌体载体系统是在eDNA文库构建中最早使用的载体系统，其主要优点是插入片段的装载容量大，适合于全长的eDNA克隆，不仅质量高、代表性好，而且重组噬菌体颗粒的感染活性在4℃环境中极其稳定，非常适合于eDNA文库的长期保存。cDNA与载体重组，或经体外包装成噬菌体颗粒后转导宿主细胞，或不经体外包装直接转染宿主细胞，但转导的效率较高。λDNA作为外源基因的克隆载体λ基因组中间部分占30%的DNA(包括重组和溶源化基因)并不是噬菌体裂解生长所必需的，裂解生长所需的基因都在基因组的左侧和右侧，而典型的λ克隆载体在部分或全部非必需基因的两侧含有限制酶位点，这就赋予了λ载体克隆大片段的能力，外源基因插入到限制酶位点之间，在体外包装成噬菌体，虽然包装效率仅达10%，但一经包装，在大肠杆菌中形成噬菌斑的效率可达100%。目前由λ衍生的许多载体被广泛地应用于基因克隆中，尤其是在构建基因文库中的应用产生了非常好的效果。二、克隆外源目的序列为了使外源基因能有效转录，将其插入λDNA的PL启动子或PR启动子的有效转录区内。λ噬菌体载体的克隆原理和步骤（1）通过裂解过程增殖载体•通过噬菌体的增殖，从中提取噬菌体DNA•噬菌体载体均含有与裂解生长所必须的基因片断，不同的载体采用不同的大肠杆菌宿主菌来增殖。经过裂解生长获得噬菌体颗粒，再经过分级分离分化，可用于提取噬菌体DNA。（2）载体与外源片断的酶切•插入型载体来说，载体被酶切后，很容易自身连接，一般对载体的进行去磷酸化。•置换型载体，切割后形成左臂、填充片断、右臂，填充片断的存在会影响连接效率，必须纯化左臂和右臂。（3）外源片断与载体的连接•通过载体的粘性末端，将载体连接成多联体，以利于将两个cos位点之间的片断装入噬菌体颗粒（4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染力的噬菌体颗粒•利用特殊材料，制备噬菌体包装蛋白•连接产物与包装蛋白混合时，就可完成包装反应，形成有感染力的噬菌体颗粒•包装蛋白对所包装的DNA大小有高度选择性，范围：λDNA分子的75％－105％λ噬菌体的改造•设计去除λDNA上的多余序列和一些限制性酶切点：因为λDNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。•在中段非必需区，替换或插入某些标志基因，如上述的可供蓝白筛选lacZ’序列和多克隆位点等。•建立重组λDNA分子的体外包装系统。•与一般的质粒载体不同,噬菌体转染前需要利用噬菌体外壳蛋白和噬菌体DNA加工酶组成的混合物(包装抽提物•)在体外将连接好的DNA线性分子包装成噬菌体颗粒草菇噬菌体基因文库的构建(见文献附件）